[發明專利]豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母及表達蛋白

有效

• 申請號: 200910027159.1
• 申請日: 2009-05-22
• 公開（公告）號: CN101565680A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 劉茂軍;邵國青;祝永琴;馮志新;王海燕;吳敘蘇;甘源
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司
• 代理人: 張素卿

一、技術領域

本發明涉及一種豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母及表達蛋白，屬于生物蛋白制備技術領域。特別是涉及豬肺炎支原體P97R1畢赤酵母表達載體的構建與表達方法。制備的蛋白可用于P97R1研究、試劑盒和基因工程疫苗的研制。

二、背景技術

豬肺炎支原體(Mycoplasma?hyopneumoniae，Mhp)是引起豬氣喘病(MPS)的病原。后者是豬群中流行最廣、傳播最快、最難凈化的疫病之一。豬肺炎支原體通過呼吸道傳播，感染呼吸道上皮后導致呼吸道纖毛萎縮、脫落、損壞，上皮細胞壞死，降低呼吸道黏膜的免疫功能，引起肺部功能損傷，容易產生其它呼吸道病原的繼發感染。據報道，該病可使豬的飼料轉化率降低10％，生長速度降低12％～15％，出欄時間延長1個月，與胸膜肺炎放線桿菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒等混合感染時，情況更為嚴重，該病一旦爆發就難以控制，給養殖業造成巨大的經濟損失。

目前對該病致病機理還不十分清楚。在檢測方面，國內外已建立了多種血清學檢測方法，如免疫瓊擴和間接血凝等，但免疫瓊擴和間接血凝法存在著靈敏度不高等問題。由于Mhp與非致病支原體之間存在著交叉反應，所以血清學檢測方法的研發困難重重。豬肺炎支原體的黏附因子(P97蛋白)被證明參與豬肺炎支原體對豬呼吸道黏膜上皮纖毛的黏附，另外，研究發現豬肺炎支原體感染時P97引發的免疫反應遠遠早于其他抗原蛋白所引起的免疫反應。Hsu等(1998)利用Tn1000插入誘變產生的不同的重組產物，初步定位了P97的黏附作用部位和抗原識別表位。免疫印跡顯示，單抗識別的表位在R1，需要至少2.5個5aa重復基元。不同重組產物的體外吸附測定表明，R1區是直接參與黏附的區域，R1區下游的序列不起作用。而且與豬體內常寄居的其他支原體進行比較后發現，P97R1區高度保守，為肺炎支原體種特異性抗原成份，無交叉反應。因此，可以應用P97R1蛋白作為抗原，建立ELISA診斷方法，對于豬支原體肺炎的早期診斷有很重要的意義。

而目前的研究主要是在大腸桿菌里對其進行表達，表達的蛋白大多以融合蛋白的形式存在，對后續應用可能存在一定的干擾，并且由于大腸桿菌成份的存在，表達蛋白需要進行煩瑣的純化后才能用于后期的研究。而巴斯德畢赤酵母表達系統是近年發展起來的一種新型真核表達系統，它既可以進行胞內表達，也可進行分泌表達。據報道，在酵母表達系統里表達結核分枝桿菌CFP32蛋白與原核表達系統表達的該蛋白的Western?Blotting結果顯示，酵母表達系統表達的該蛋白與抗體的結合能力更強，而且ELISA結果也顯示，結核病人的血清以及接種過疫苗的健康人的血清與酵母表達的CFP32蛋白的結合能力較原核表達的該蛋白強。因此，選用了酵母表達系統表達P97R1蛋白具有較好的前景。

三、發明內容

技術問題

針對上述領域中的缺陷，本發明提供了一種豬肺炎支原體P97R1基因畢赤酵母表達系統，其表達蛋白純度高、工藝簡單、生物安全度高、成本低廉、易于生產和應用等特點，為進一步研究P97蛋白、開發研制檢測試劑盒和基因工程疫苗奠定基礎。

技術方案

本發明的具體實施方案如下：

1.豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母GS115/pPICZα-A/P97R1屬巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)，于2009年4月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，菌種保藏號為CCTCC?NO：M209071。

上述豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母GS115/pPICZα-A/P97R1的構建方法，包括：

1)引物設計

設計兩條引物，序列為：

P1：5′ATAGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAG?3′EcoR?I

P2：5′CGCTCTAGAAAGCCATTGGGAAATAG?3′??Xba?I

2)PCR獲取P97R1目的基因

以P1和P2為引物，豬肺炎支原體JS99株DNA為模板進行PCR擴增，回收PCR擴增產物；

3)將獲取的目的基因克隆入pPICZα-A表達載體并進行序列測定PCR產物和pPICZα-A均用EcoR?I、Xba?I雙酶切，T4DNA連接酶連接，連接產物轉化E.coli?DH5α，重組表達質粒用EcoR?I、Xba?I雙酶切進行鑒定陽性的測序，構建正確的重組表達質粒命名為pPICZα-A/P97R1；