[發明專利]帶背景驗證的信號組合編碼DNA連接測序方法

有效

• 申請號: 200910026890.2
• 申請日: 2009-06-03
• 公開（公告）號: CN101597643A
• 公開（公告）日: 2009-12-09
• 發明（設計）人: 陸祖宏;涂景;白云飛;李燕強;肖鵬峰
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司
• 代理人: 奚勝元

1.一種帶背景驗證的信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特征在于針對某一種特定的 DNA測序探針，使用一組標記物狀態的組合進行標記，一組標記物中的一種作為背景標 記物，剩余的標記物作為編碼標記物，對于一批DNA測序探針，采用編碼標記物狀態的 不同組合方案結合背景標記物進行標記，制備一套帶背景驗證的信號組合編碼的DNA測 序探針，從而實現在檢測時對不同DNA測序探針的區分和鑒別；所述標記物的狀態，包 括標記物“有信號”、“無信號”兩種狀態，以及標記物不同信號強度比例的狀態：

A??一套帶背景驗證的信號組合編碼的DNA測序探針的制備：首先制備未標記的DNA 測序探針，每一種未標記的DNA測序探針由一個或多個測序堿基、一個或多個簡并 堿基N組成；測序堿基用于通過堿基互補配對法則測定待測DNA中相應位置的堿基 信息，簡并堿基N為A、T、C、G四種堿基中的任意一個；完成未標記的DNA測序 探針的制備后，針對每一種未標記的DNA測序探針，采用多種編碼標記物狀態的一 種組合進行標記，同時標記背景標記物，每種編碼標記物在該DNA測序探針上標記 與否及標記的量由該編碼標記物在狀態的組合中所對應的狀態決定；采用不同的狀態 組合方案結合背景標記物對不同的未標記DNA測序探針進行標記，完成一套帶背景 驗證的信號組合編碼的DNA測序探針的制備；

B??利用上述一套帶背景驗證的信號組合編碼的DNA測序探針的測序流程如下：

a.選取一條測序引物與待測的DNA模板依據堿基互補配對原理進行雜交；

b.向反應體系中加入上述的一套帶背景驗證的信號組合編碼的DNA測序探針和 DNA連接酶及其反應體系，進行DNA連接反應；

c.完成DNA連接反應后，檢測全部參與狀態組合的標記物及背景標記物的信號， 首先判讀背景標記物是否符合校驗，如符合，判讀編碼標記物信號所處的狀態， 根據全部編碼標記物狀態的組合情況，確定發生連接反應的DNA測序探針的種 類，從而確定該測序探針上測序堿基的類型和排布，并最終確定被測DNA模板 上對應位置的堿基或堿基序列信息；

d.完成對標記物信號的檢測后，移除DNA測序探針上的標記物；

e.重復上述步驟b-d直至DNA測序探針達到或超出待測DNA模板待測區域末端；

f.該測序引物與待測DNA模板變性分離，選取第二條測序引物；

g.重復上述步驟a-f，直至全部未知DNA模板的待測區域的全部序列信息得以確定。

2.根據權利要求1所述的帶背景驗證的信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特征在于所 述的多種標記物對未標記DNA測序探針進行組合標記，其方案是對同一DNA測序探針 分子同時標記一種或多種標記物，或者分別用不同的標記物標記同一種DNA測序探針的 不同分子，隨后將上述不同測序探針分子混合。

3.根據權利要求1所述的帶背景驗證的信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特征在于所 述的測序引物是指一組只能和所有DNA模板的一段通用序列雜交的寡核苷酸片段，一組 測序引物在DNA模板上雜交區域彼此相差一個或數個堿基，能夠在數輪測序反應中完成 對DNA模板全長的測序工作；測序模板上的通用序列，是在測序模板制備過程中通過連 接反應加入，或者在擴增過程中通過引物引入。

4.根據權利要求1所述的帶背景驗證的信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特征在于所 述的DNA模板是通過對待測的DNA片段通過DNA擴增技術增加基因組中感興趣的目的 片段的量，擴增是單重的，即一次擴增一個目的片段，或者是多重的，即一次擴增多個目 的片段；所述的待測的DNA模板中的固定是通過化學或者物理方法固定于平面片基上， 或固定于“96孔板”、“384孔板”及各種修飾的珠子載體上。

5.根據權利要求1所述的帶背景驗證的信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特征在于所 述的標記物，是采用的熒光基團，或利用測序探針化學的、物理的性質的改變。