[發(fā)明專利]雞痘病毒rFPV-AIH5/IL2及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910025600.2
• 申請日: 2009-02-11
• 公開（公告）號: CN101486997A
• 公開（公告）日: 2009-07-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭大新;劉秀梵;云水麗;陳素娟;吳艷濤;張小榮;劉武杰
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學(xué)
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;A61K39/275;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所
• 代理人: 盧亞麗

1、一種雞痘病毒(Fowlpox?virus)rFPV-AIH5/IL2CGMCC?NO：2831。

2、如權(quán)利要求1所述雞痘病毒rFPV-AIH5/IL2制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)獲得含H5亞型AIV?HA基因整個閱讀框架的基因片段；

(2)獲得含chiIL-2基因整個閱讀框架的基因片段；

(3)將上述基因片段置于各自合適的啟動子下游，背向串聯(lián)插入到含F(xiàn)PV復(fù)制非必需片段FPV12和報告基因的雞痘病毒表達(dá)載體pP12LS中構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體pP12HAIL-2，長度為12745bp；

(4)用轉(zhuǎn)移載體pP12HAIL-2轉(zhuǎn)染已感染wt-FPV的雞胚成纖維細(xì)胞，通過同源重組獲得共表達(dá)H5型AIV?HA基因和chiIL-2基因的重組雞痘病毒rFPV-AIH5/IL2。

3、根據(jù)權(quán)利要求2所述雞痘病毒rFPV-AIH5/IL2的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，H5亞型AIV?HA基因可以通過以下方法獲得，用9-10日齡SPF雞胚擴(kuò)增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因組的RNA，通過以下引物

PH5A1??5’-GGATCCGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTCTTTCTT-3’

PH5A2??5’-GTCGACAAAAAAATCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTG-3’

先反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后PCR擴(kuò)增出H5亞型AIV?HA基因整個閱讀框架。

4、根據(jù)權(quán)利要求2所述雞痘病毒rFPV-AIH5/IL2的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，chiIL-2基因由本實驗室構(gòu)建質(zhì)粒pT-IL2，通過以下引物，

PchiIL-2-1??5’-AAAGGATCCGCCACCATGATGTGCAAAGTACTGATC-3’PchiIL-2-2??5’-CCCTCTAGAAAGCTTATAAAAATTATTTTTGCAGATATCTCAC-3’

通過PCR擴(kuò)增出chiIL-2基因整個閱讀框架。

5、根據(jù)權(quán)利要求2所述雞痘病毒rFPV-AIH5/IL2的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，啟動子是任何能夠在重組雞痘病毒感染細(xì)胞中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的FPV早晚期啟動子、痘苗病毒早晚期啟動子或人工合成早晚期啟動子。

6、根據(jù)權(quán)利要求2或5所述雞痘病毒rFPV-AIH5/IL2的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，啟動子和步驟(1)、(2)所得基因通過酶切加接的方法或用PCR設(shè)計引物加接的方法連接在一起，按常規(guī)方法將其插入到含F(xiàn)PV復(fù)制非必須片段FPV12和報告基因LacZ的FPV表達(dá)載體中。

7、根據(jù)權(quán)利要求2所述雞痘病毒rFPV-AIH5/IL2的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，用GeneJammer轉(zhuǎn)染試劑將轉(zhuǎn)移載體分別與wt-FPV共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞，將上清稀釋液接種長成致密單層的CEF，待出現(xiàn)單個典型蝕斑后，用含有X-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，藍(lán)斑篩選純化得重組病毒rFPV-AIH5/IL2。

8、根據(jù)權(quán)利要求2所述雞痘病毒rFPV-AIH5/IL2的制備方法，其特征在于，將共表達(dá)H5亞型AIV?HA基因和chiIL-2基因的rFPV在CEF單層上增殖，使病毒在CEF中大量擴(kuò)增。

9、權(quán)利要求1所說的雞痘病毒rFPV-AIH5/IL2的在制備預(yù)防H5亞型禽流感疫苗中的應(yīng)用。