[發明專利]乙肝病毒HBV熒光定量PCR檢測引物與探針

無效

• 申請號: 200910024424.0
• 申請日: 2009-02-24
• 公開（公告）號: CN101812533A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發明（設計）人: 符芳芳;李楊霞;于秀菊
• 申請（專利權）人: 江蘇默樂生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 泰州地益專利事務所 32108
• 代理人: 王楚云

技術領域

本發明是一種用于檢測乙肝病毒HBV核苷酸序列的的引物和探針。

背景技術

乙型肝炎病毒(HBV)，嗜肝DNA病毒科。全世界有3.5億人攜帶乙肝病毒，每年有近100萬人死于乙肝相關并發癥，包括肝硬化、肝細胞癌。我國是乙型肝炎高發區，約57.6％的人口過去或現在受到過乙型肝炎病毒的感染，他們中仍有約1.2億人攜帶乙肝病毒，現癥患者已超過2000萬人。乙肝病毒攜帶者中，50％--75％的人有活動性病毒復制的慢性乙肝，估計5年中從慢性乙肝進展為肝硬化的發生率為2％-20％；從代償性肝硬化到肝臟失代償為20％-23％；從代償肝硬化到肝癌為6％-15％。慢性乙肝是進展為肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌的首要危險因素乙肝病毒攜帶者中，50％--75％的人有活動性病毒復制的慢性乙肝，估計5年中從慢性乙肝進展為肝硬化的發生率為2％-20％；從代償性肝硬化到肝臟失代償為20％-23％；從代償肝硬化到肝癌為6％-15％。HBV的傳染性很強，接種0.00004ml含病毒血液足以使人發生感染。而乙肝病毒又常常產生突變，這給乙肝的確診和治療帶來極大的麻煩，所以迫切需要一種既準確又快速的實驗室檢驗方法來檢測乙肝病毒。

乙肝病毒的檢測技術包括：免疫學檢測方法，包括酶聯免疫分析法，膠體金免疫層析測定法，免疫熒光法和固相放射免疫法；分子生物學檢測方法，包括核酸探針法，PCR法和基因芯片法。其中，PCR檢測法簡便、快速，近年來，在臨床檢測中備受青睞，但是，普通PCR檢測易產生污染。，實時熒光定量PCR法檢測HBV-DNA較傳統定性PCR技術操作簡便，檢測時不需打開反應管便可測出定量結果，從而減少污染機會，同時提高了檢測靈敏度、特異性及整個操作的自動化程度。其特異、靈敏且準確等優點，在人類傳染病和病原定量上的應用日益廣泛。在實時熒光定量PCR檢測方法中，引物和探針的設計尤為重要，決定了檢測結果的有效性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測HBV?DNA的引物和探針。

基于上述目的，本發明采用以下技術方案：

用于檢測HBV?DNA的引物和探針序列包括：

上游引物HBVF的序列為：5′TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3′，

下游引物HBVR的序列為：5′GCACAGCTTGGAGGCTTGA3’，

探針HBVP的序列為：5′FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3’

本發明的原理為：在傳統的PCR擴增體系中加入一個與靶序列特異互補的雙熒光標記寡核苷酸探針，探針的5’端設計了一個報告熒光基團，3’端設計了一個淬滅熒光基團。在探針完整的情況下，報告熒光基團發出熒光被淬滅熒光基團吸收，此時檢測不到熒光信號。當有特異PCR產物時，復性時，標記探針與靶序列結合互補，形成局部雙鏈產生適合于5’-3’核酸外切酶外切活性的底物，激活Tag聚合酶的5’外切酶活性，將5’的熒光分子切除，這樣，報告熒光基團與淬滅熒光基團分離，淬滅作用被解除，產生熒光信號，通過熒光定量PCR儀檢測熒光度，即可測得最終的定量結果。

附圖說明

利用引物對HBVF/HBVR和探針HBVP檢測HBV?DNA陽性樣品的熒光定量PCR圖。

見附圖一。

具體實施方式

1，引物和探針的設計：通過分別對所有已知的乙肝病毒基因序列比較分析，選擇高保守的區段，設計多對引物和探針，最優的引物和探針如下：

上游引物HBVF：5′TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3′

下游引物HBVR：5′GCACAGCTTGGAGGCTTGA3’

探針HBVP：5′FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3’

2，反應體系的優化：利用病人血清作為待檢樣品，分裝后儲存于-20℃

2.1引物濃度的優化：在反應體系中其他組分相同的情況下，將HBV引物濃度分別從0.1μM到2.0μM作倍比連續稀釋，通過實驗結果的分析比較，確定最優引物濃度為0.5μM。

2.2探針濃度的優化：在反應體系中其他組分相同的情況下，將HBV探針濃度分別從0.01μM到1.0MM作倍比連續稀釋，通過實驗結果的分析比較，去頂最優探針濃度為0.05μM。

利用上述引物和探針進行反應體系的建立，最后確定，HBV?DNA熒光定量PCR的最優體系為40μL。

3.儀器檢測通道的選擇

選擇的熒光檢測通道應與探針所標記的報告熒光基團一致，具體按照儀器使用說明書進行設置。