[發(fā)明專利]表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球及其制備方法和用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910023604.7
• 申請(qǐng)日: 2009-08-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101628224A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-01-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮國(guó)棟;楊磊;胡道道;崔亞麗;陳超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 陜西北美基因股份有限公司
• 主分類號(hào): B01J20/286
• 分類號(hào): B01J20/286;B01J20/28;B01J20/30;B01J13/02;H01F1/11;C07H1/06;C07H21/04
• 代理公司: 西安智邦專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 徐 平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于材料合成、應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種用于生物樣品中分離核酸的 材料，具體涉及一種表面修飾二乙胺基乙基(DEAE)的磁性二氧化硅微球及 其制備方法和用途。

背景技術(shù)

生物磁分離技術(shù)是在傳統(tǒng)磁分離技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)，以細(xì)胞、細(xì)菌、 核酸和蛋白質(zhì)等生物體為應(yīng)用對(duì)象的高效分離技術(shù)。它利用磁性或磁性標(biāo)記 生物體在外磁場(chǎng)作用下做定向運(yùn)動(dòng)這一特性，對(duì)目標(biāo)生物體進(jìn)行提取、富集、 分離和純化。早期的工作主要集中于發(fā)展磁性標(biāo)記物的制備技術(shù)上，包括通 過(guò)在磁流體中浸漬將磁性納米粒子吸附到瓊脂糖、聚丙烯酰胺、聚戊二醛和 聚乙烯醛等聚合物微球中。這種微球以顆粒大小分布均勻和磁性粒子含量均 勻?yàn)樘卣鳎ＷC了不同生物分離過(guò)程的可重現(xiàn)性和可控性。生物磁分離技術(shù) 與標(biāo)準(zhǔn)分離步驟相比有一定優(yōu)勢(shì)。首先磁分離過(guò)程通常非常簡(jiǎn)單，只涉及幾 個(gè)處理步驟，所有的純化步驟都可在單個(gè)試管或者容器中發(fā)生，不需要昂貴 的液相色譜系統(tǒng)、離心機(jī)、過(guò)濾器或者其它設(shè)備。分離過(guò)程可以在含有懸浮 固體物質(zhì)的粗制樣品上直接進(jìn)行。在某些情況下，例如細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的提取， 甚至可以整合裂解和分離步驟，從而縮短整個(gè)分離時(shí)間。磁分離技術(shù)對(duì)細(xì)胞、 蛋白質(zhì)和核酸等生物體通常是非常溫和的。與高速離心和親和色譜相比，磁 分離技術(shù)具有較低的剪切力，能較好地保持被分離細(xì)胞的活力和生物分子的 生物活性。

目前，生物磁分離技術(shù)正在成為生命科學(xué)研究的一個(gè)重要手段。在分子 生物學(xué)領(lǐng)域中，核酸是現(xiàn)代生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究中的重要課題。作為遺傳信息 的攜帶者，DNA是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，除在生物體正常生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖 等生命活動(dòng)中的作用外，它與生命異常如腫瘤的發(fā)生、遺傳疾病等也密切相 關(guān)。因此，對(duì)核酸分離純化是許多研究領(lǐng)域的重要前提和保障。

目前常見(jiàn)的核酸分離方法有酚提取/沉淀法、層析法、密度梯度離心法等。 這些傳統(tǒng)方法往往比較費(fèi)時(shí)，步驟繁瑣，需使用有機(jī)試劑，有損操作者健康。 所以有必要研究一種新的快速、方便的提取基因組DNA的方法。

Levison應(yīng)用一種以磁性瓊脂糖微球作為基質(zhì)，表面修飾二乙胺基乙基 (DEAE)的磁性微球用于核酸提取。但其與核酸結(jié)合能力不高，每毫克磁粒 僅能結(jié)合約3.5μg核酸。

孫敏莉通過(guò)磁性納米粒子與葡聚糖-DEAE包裹的方法合成一種磁性葡聚 糖-DEAE微球，并應(yīng)用于大場(chǎng)桿菌中提取質(zhì)粒，但未用于全血中核酸的提取。

上述兩種表面修飾DEAE的磁性微球，由于DEAE直接修飾在基質(zhì)的碳 羥基上，功能基團(tuán)DEAE與基質(zhì)距離較近，核酸與DEAE結(jié)合過(guò)程中受空間 位阻的影響較大，所以該磁球結(jié)合核酸能力不高。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決背景技術(shù)中存在的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種表面修飾 二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球及其制備方法及其用途，該方法設(shè)計(jì)合理、 工藝可行，依該方法制備出的微球提取核酸量大，該微球可應(yīng)用于生物樣品 中分離核酸。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球，其化學(xué)式為：

Fe₃O₄/SiO₂-GPTMS-DEAE

上述表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制備方法，包括以下 步驟：

(1)制備磁性二氧化硅微球；

(2)磁性二氧化硅微球的環(huán)氧基化；

(3)二乙胺基乙基表面修飾：

(3.1)將步驟(2)制得的表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球與稀鹽酸 混合，邊攪拌邊加熱反應(yīng)；

(3.2)反應(yīng)完畢后，磁性分離，得到沉淀物，將沉淀物用二次水洗滌；

(3.3)將二乙胺基乙基與NaOH水溶液混合溶解，加入步驟(3.2)洗滌 后的沉淀物，攪拌均勻，通過(guò)調(diào)節(jié)二乙胺基乙基和NaOH水溶液的相對(duì)量使 該混合溶液pH值至8～9，加熱反應(yīng)；

(3.4)反應(yīng)完畢后，磁性分離，得到沉淀物，將沉淀物用二次水洗滌，再 用STET溶液洗滌后，放入STET溶液中，制備成表面修飾二乙胺基乙基的磁 性二氧化硅微球。

上述步驟(3.1)稀鹽酸的濃度為0.01～0.05mol/L，表面鍵合環(huán)氧基的磁 性二氧化硅微球與稀鹽酸的質(zhì)量比為1∶100～500，攪拌速度為600～800轉(zhuǎn)/ 分鐘，加熱至80～100℃，反應(yīng)時(shí)間為2～4小時(shí)；