[發(fā)明專利]一種檢測黃牛Six6基因單核苷酸多態(tài)性的方法

無效

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• 申請日: 2009-08-14
• 公開（公告）號: CN101629209A
• 公開（公告）日: 2010-01-20
• 發(fā)明（設計）人: 陳宏;淮永濤;藍賢勇;王璟;馬亮;屈玉嬌;任剛;賴新生;胡沈榮;雷初朝
• 申請（專利權）人: 西北農(nóng)林科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/447
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司
• 代理人: 陸萬壽

生物技術領域

本發(fā)明屬于分子遺傳學領域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測， 特別涉及一種檢測黃牛Six6基因第2015位單核苷酸多態(tài)性的方法。

背景技術

單核苷酸多態(tài)性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸 (A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。因此，通常所說的SNPs包括堿基的 替換、插入、缺失以及重復序列拷貝數(shù)的變化。一個SNP表示在基因組某個 位點上有一個核苷酸的變化，主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起；具有 轉(zhuǎn)換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG二核苷 酸的胞嘧啶是基因組中最易發(fā)生突變的位點，其中大多數(shù)是甲基化的，可自 發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。

在任何已知或未知的基因內(nèi)或附近都可能找到數(shù)量不等的SNPs，根據(jù)它 們在基因組中分布的位置可分為基因編碼區(qū)SNPs(cSNPs)、基因周邊SNPs (pSNPs)和基因間SNPs(iSNPs)等三類。總的說來，cSNP比較少，因為 在外顯子內(nèi)的變異率僅占周圍序列的1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻 具重要意義，因此倍受關注。根據(jù)對遺傳性狀的影響，cSNPs又可分為兩種： 一種是同義cSNPs，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì) 中氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的“含義”相同；另一種是非同義 cSNPs，即堿基序列的改變將導致編碼氨基酸的改變，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列 的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。因此，對編碼區(qū)SNPs的非同義突 變來說，它們可能對基因功能有直接的重要影響；尤其對于無義密碼子突變 來說，更可能會導致所編碼的蛋白發(fā)生重大變化，從而影響它的功能發(fā)揮， 對個體的表現(xiàn)型產(chǎn)生重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs 作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。

由于SNPs是二等位基因分子標記，所以，理論上在一個二倍體生物群 體中，SNPs可能是由2個、3個或4個等位基因構成，但實際上3個或4個 等位基因的SNPs很罕見，故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標記。 目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn)SNPs：即DNA序列測定方法、 PCR-SSCP與DNA測序結合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接 反應等。在這些SNP檢測技術中，DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測 方法，但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同 時，在測序過程中需要非常熟練的技術人員和經(jīng)驗，所以，DNA序列測定法 不是一種應用于生產(chǎn)實際的理想SNP檢測方法；當然，利用PCR-SSCP與 DNA測序結合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實 驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并 非理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未 來的應用領域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設計特別的引物， 且只能針對特定的基因位點，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此， 目前不具有普遍應用的特點；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應技術檢測 SNP位點，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術和質(zhì)譜儀等檢測平臺， 對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。

RFLP-PCR方法是一種檢測SNP的有效技術，在發(fā)現(xiàn)SNP位點后引入 限制性內(nèi)切酶進行切割，然后進行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確 地鑒別SNP位點。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服 了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要 求。

Six基因家族已于斑馬魚、人類以及小鼠等許多物種中被鑒定出來。在脊 椎動物中，Six基因家族的成員廣泛地在許多組織中表達，其在調(diào)控胚胎正常 的形態(tài)發(fā)育、器官發(fā)育及細胞的分化上扮演著重要的角色。Six6基因?qū)儆谙? 垂體分泌過程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，主要參與調(diào)控體內(nèi)一些發(fā)育相關基因的表 達，或者稱之為選擇基因(selector?gene)。這類基因是發(fā)育調(diào)控基因的最基 層層次，其表達受上級發(fā)育調(diào)控基因和同層次上的其他同源異型基因的作用； 從它們表達的多肽組成及性質(zhì)看，又是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，直接調(diào)節(jié)實施基 因(realization?gene，屬結構基因范疇)的表達活性。因此，Six6基因遺傳變 異或SNP位點在動物生產(chǎn)實踐中對胚胎形成、生長激素的調(diào)控、垂體分泌、 眼睛發(fā)育調(diào)控等具有重要的作用。