[發(fā)明專(zhuān)利]耐熱菌的ELISA快速檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910022897.7
• 申請(qǐng)日: 2009-06-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101566632A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李建科;王峰;余朝舟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/569
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/569;G01N33/543;G01N33/531;G01N21/31
• 代理公司: 西安集思得知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 張晉吉

1.耐熱菌的ELISA快速檢測(cè)方法，其特征是按以下操作步驟進(jìn)行：

a耐熱菌的捕集

a.1取10-20g待檢蘋(píng)果濃縮汁，以無(wú)菌水適度稀釋?zhuān)?

a.2用溶劑過(guò)濾器過(guò)濾捕集耐熱菌，濾膜孔徑0.45μm，

a.3耐熱菌被截留于濾膜表面；

b耐熱菌預(yù)增菌

b.1采用402培養(yǎng)基預(yù)增菌14-15h，

b.2將增菌后的培養(yǎng)液以10000-12000rpm/min，離心10-15min；

c耐熱菌包被酶標(biāo)板

c.1用0.05mol/L、pH9.6的碳酸緩沖液制成菌懸液作為包被液，

c.2將包被液均勻加到酶標(biāo)板中，每孔100-150μL，

c.3酶標(biāo)板在55-60℃烘箱中2-3h烘干，

c.4用0.01mol/L，pH7.4的PBS-吐溫20洗板，

c.5每隔1分鐘洗板一次，共洗板5-6次，

c.6洗完之后，倒扣酶標(biāo)板，輕輕拍掉懸浮液珠；

d封閉酶標(biāo)板

d.1封閉液為5％-8％的脫脂奶粉，

d.2將封閉液均勻的加到酶標(biāo)板各孔中，每孔200-300μL，

d.3在37℃溫箱中孵育2-3h，

d.4洗板

d.4.1用0.01mol/L、pH7.4的PBS-吐溫20洗板，

d.4.2每隔1分鐘洗板一次，共洗板5-6次，

d.4.3洗完之后，倒扣酶標(biāo)板，輕輕拍掉懸浮液珠；

e加耐熱菌多克隆抗體

e.1耐熱菌多克隆抗體為免疫大白兔得到的多克隆抗體，

e.2免疫程序?yàn)椋?

e.2.1給大白兔耳靜脈注射耐熱菌，注射的耐熱菌濃度為1×10⁸-1 ×10⁹個(gè)/mL，每隔4天注射一次，共注射6次，第一次注射量為0.5mL， 以后每次注射量比上一次增加0.5mL，

e.2.2免疫注射6次后，于第22-25天取血，分離血清即為耐熱菌多 克隆抗血清，

e.2.3將耐熱菌多克隆抗血清經(jīng)過(guò)鹽析、DEAE-纖維素層析純化即得耐 熱菌多克隆抗體，

e.3耐熱菌多克隆抗體與PBS-吐溫20的稀釋比例為1∶1600，

e.4將稀釋的耐熱菌多克隆抗體加到酶標(biāo)板各孔中，每孔100-150μL，

e.5在37℃溫箱中孵育1-2h，

e.6洗板

e.6.1用0.01mol/L、pH7.4的PBS-吐溫20洗板，

e.6.2每隔1分鐘洗板一次，共洗板5-6次，

e.6.3洗完之后，倒扣酶標(biāo)板，輕輕拍掉懸浮液珠；

f加酶標(biāo)抗體

f.1酶標(biāo)抗體為酶標(biāo)山羊抗兔抗體，

f.2酶標(biāo)抗體與PBS-吐溫20的稀釋比例為1∶20000，

f.3將稀釋的酶標(biāo)抗體加到酶標(biāo)板各孔中，每孔加100-150μL，

f.437℃溫箱中孵育1-2h，

f.5洗板

f.5.1用0.01mol/L，pH7.4的PBS-吐溫20洗板，

f.5.2每隔1分鐘洗板一次，共洗板5-6次，

f.5.3洗完之后，倒扣酶標(biāo)板，輕輕拍掉懸浮液珠；

g加底物工作液

g.1底物工作液配方如下：

g.1.1取25.7mL?0.2mol/L?Na2HPO4和24.3mL?0.1mol/L檸檬酸液放入 100mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度即為底物緩沖液，

g.1.2精確稱取0.02g?3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺粉末，溶于20mL無(wú) 水乙醇，即為3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺母液，

g.1.3底物緩沖液與3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺母液按1∶1的比例混 合，每毫升混合液再加入2μL?30％H₂O₂即為底物工作液，

g.2將底物工作液加到酶標(biāo)板各孔中，每孔加100-150μL，

g.3反應(yīng)15-20min，

g.4加終止液終止反應(yīng)，

g.4.1終止液為2mol/L的硫酸，

g.4.2酶標(biāo)板每孔各加50-75μL；

h酶標(biāo)儀測(cè)定

h.1將終止反應(yīng)的酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，

h.2在波長(zhǎng)為450nm處測(cè)定0D值，

h.3以(樣品孔0D值-陰性孔OD值)/陰性孔0D值≧2.1為陽(yáng)性判斷 標(biāo)準(zhǔn)，

h.3.1樣品孔為加經(jīng)捕集并經(jīng)預(yù)增菌處理的樣品液，以及耐熱菌多克 隆抗體、酶標(biāo)抗體、底物工作液及終止液的酶標(biāo)孔，

h.3.2陽(yáng)性樣為加耐熱菌抗原，以及耐熱菌多克隆抗體、酶標(biāo)抗體、 底物工作液及終止液的酶標(biāo)孔，

h.3.3陰性孔為不加耐熱菌抗原，而加耐熱菌多克隆抗體、酶標(biāo)抗體、 底物工作液及終止液的酶標(biāo)孔。