[發明專利]建立油菜細胞質類型特異PCR標記以及快速鑒定油菜細胞質類型的方法

無效

• 申請號: 200910022297.0
• 申請日: 2009-04-30
• 公開（公告）號: CN101608198A
• 公開（公告）日: 2009-12-23
• 發明（設計）人: 胡勝武;趙惠賢;李占杰
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12Q1/68
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所
• 代理人: 李鄭建

技術領域

本發明涉及油菜細胞質類型的鑒定，尤其涉及建立油菜細胞質類型目標 基因特異PCR標記的方法，以及利用建立的標記快速鑒定油菜細胞質類型的 方法。

背景技術

油菜細胞質具有高度異質性，是由細胞質基因組載體-線粒體基因組 DNA序列決定的，不受油菜細胞核基因以及環境因素的影響。目前，國內外 已報道的油菜細胞質類型較多，常見的細胞質類型主要有：Nap細胞質類型 (Nap)、波里瑪系統細胞質(Pol)/陜2A細胞質類型、Cam細胞質類型、 蘿卜質細胞質類型(Ogu)等。

目前，油菜細胞質類型主要通過普通遺傳學方法研究、線粒體基因組 DNA的限制性酶切片段長度多態性(即mtDNA-RFLP)標記2種進行鑒定。用 普通遺傳學方法對正常油菜品種的細胞質類型鑒定，一般用待測油菜品種做 母本(人工去雄)，與某種已知細胞質雄性不育類型的保持系雜交，根據該 組合F₂群體中是否出現不育株，來確定待測品種的細胞質類型。如果F₂群 體出現不育株，則說明待測品種具有該種不育胞質；如果全可育，則說明待 測品種具有相對于該種不育胞質來說，稱為正常可育的胞質。該方法需要進 行油菜雜交試驗，一般需要3個時代(2～3年)時間；費時費力，且每種 雜交組合只能確定待鑒定油菜和某種已知胞質類型的油菜是否為相同的細 胞質；如果不是相同的細胞質類型，則仍不能確定待鑒定油菜的細胞質到底 是那種類型。利用上述遺傳學方法，Shiga(1976，1977，1978)對來自日 本和歐洲的162個油菜品種，胡瓊等(1992)對來自8個國家的43個油菜 品種的細胞質類型進行了鑒定。隨著分子生物學理論和技術的發展，有些研 究者已通過分離提取油菜線粒體基因組(mtDNA)，利用mtDNA-RFLP標 記(楊光圣等，中國農業科學，1998，31(1)：27-31)或基因組重復序列 的PCR技術(rep-PCR)(程計華等，作物學報，2008，34(11)：1946-1952) 區別和鑒定油菜各種細胞質類型。利用這兩種分子標記方法鑒定油菜細胞質 類型，與普通遺傳學方法比較，實驗周期大大縮短，但是都需分離純化油菜 線粒體和提取線粒體DNA，且mtDNA-RFLP方法需要進行mtDNA的限制 性酶切和酶切片段的分離檢測，操作程序繁瑣、復雜、技術難度大而且成本 高。

目前，甘藍型油菜Nap細胞質類型的線粒體全基因組已被測序。國內外 研究已表明，不同油菜細胞質類型的mtDNA組織結構差異較大；油菜細胞 質雄性不育系的線粒體基因組中具有與其細胞質雄性不育相關的特異基因 片段。研究已揭示出Ogu、Nap和Pol等不育系的不育性狀相關的線粒體基 因序列分別為其mtDNA的特異讀碼框Orf138、orf222/nad5c、以及 Orf224/atp6。危文亮等(2005，中國農業科學，38(10)：1965-1972)根據 油菜線粒體基因Orf138、orf222/nad5c、以及Orf224/atp6序列和已發表的擬 南芥線粒體基因組序列設計PCR引物，可特異擴增出目標片段。程計華等(作 物學報，2008，34(11)：1946-1952)也得到類似的實驗結果。mtDNA這 些特異基因序列是受細胞質遺傳的，不受油菜細胞核基因以及環境因素的影 響。因此，依據不同細胞質類型油菜線粒體DNA特異序列開發的分子標記可 作為鑒定油菜細胞質類型的可靠分子標記。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種建立油菜細胞質類型目標基因特異PCR 標記的方法，以及利用建立的該油菜細胞質類型目標基因特異PCR標記，用 于快速鑒定油菜細胞質類型的用途。

為了實現上述任務，本發明采取如下的技術解決方案：

一種建立油菜細胞質類型目標基因特異PCR標記的方法，其特征在于， 該方法包括下列步驟：

1)以已知細胞質類型的甘藍型油菜：包括Nap類型、Pol類型、Ogu 類型和Cam類型的gDNA為模板，用以下3對擴增引物對目標基因Orf138、 orf222/nad5c、orf224進行一步多重PCR擴增，其中：

第一對引物的序列為：

GAAACGGGAAGTGACAAT

GCATTATTTTCTCGGTCCAT；

第二對引物的序列為：

AGCTGTCTGGAGGGAATC