[發(fā)明專利]滸苔微世代的熒光原位雜交檢測方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 200910020282.0 | 申請日： | 2009-04-04 |
| 公開（公告）號： | CN101851666A | 公開（公告）日： | 2010-10-06 |
| 發(fā)明（設計）人： | 張曉雯;葉乃好;毛玉澤;莊志猛;王清印 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68;G01N21/64;C12N15/11 |
| 代理公司： | 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002 | 代理人： | 馬馳;周秀梅 |
| 地址： | 266071 *** | 國省代碼： | 山東;37 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 滸苔微 世代 熒光 原位雜交 檢測 方法 | ||
1.滸苔微世代的熒光原位雜交檢測方法，其特征在于：
用于FITC標記原位雜交檢測滸苔微世代的寡核苷酸探針為如下4種探針之一或一種以上，
1)5’-GCCCGCCGTTTACAGGAT-3’
2)5’-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3’
3)5’-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3’
4)5’-GGAGCCCTAACCCATTGAA-3’
于它們的5’端采用FITC標記的辦法。
2.按照權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于：用于FITC標記原位雜交檢測滸苔微世代的寡核苷酸探針為如下2種探針之一或二種，
2)5’-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3’，
3)5’-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3’。
3.按照權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于：原位雜交的具體過程為，
1)樣品的制備和預處理
將現(xiàn)場海水水體樣品進行濃縮后，對藻的自發(fā)熒光進行固定、脫色：用離心管于5000g/min離心樣品5min，加入乙醇至終體積濃度1％固定，靜置1-2小時，得濃縮脫色后的樣品，上帶有聚碳酸酯膜的過濾器上過濾，使細胞留在聚碳酸酯膜上；分別采用1×PBS和雜交緩沖液過濾清洗濾膜；
2)雜交：將濾膜置于載玻片上，直接加入雜交緩沖液和熒光探針，使探針終濃度達到5-10ng/μL；將玻片置于溫濕的暗處46-50℃雜交2-3h；
3)漂洗去除未結(jié)合的探針：用預熱至50℃的1×SET的雜交清洗液浸泡洗滌濾膜來終止雜交反應，洗滌后用干凈濾紙吸干濾膜；
4)檢測雜交信號，進行結(jié)果分析
加入封片劑和終濃度為1μg/mL?DNA標記物DAPI的混合液，復染并防止熒光淬滅。蓋上蓋玻片并封片，儲存于暗處以備檢測。雜交后的藻細胞以熒光顯微鏡觀察雜交效果，并記錄陽性標記率；觀察FITC熒光標記的藻細胞時應用450-490nm的激發(fā)光波長、510-520nm發(fā)射光波長的濾光片組合觀察，觀察確認水樣中存在的滸苔微世代。
4.按照權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于：所述海水水體樣品采集后用篩絹過濾濃縮。
5.按照權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于：所述雜交緩沖液的組成為0.9M?NaCl，20mmol/LTris-HCl，pH7.2，0.1％(v/v)Nonidet-P40，20％(v/v)甲酰胺。
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