[發明專利]一種雙色競爭性熒光定量聚合酶鏈反應檢測試劑盒

有效

• 申請號: 200910020242.6
• 申請日: 2009-03-30
• 公開（公告）號: CN101525661A
• 公開（公告）日: 2009-09-09
• 發明（設計）人: 夏慶杰;楊林
• 申請（專利權）人: 山東亞大藥業有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司
• 代理人: 王汝銀

技術領域

本發明涉及一種雙色競爭性熒光定量聚合酶鏈反應(dual?color?competitivefluorescence?quantitative?polymerase?chain?reaction，DCC-FQ-PCR)檢測試劑盒，具體是涉及一種21號染色體倍性檢測的雙色熒光定量聚合酶鏈反應體外競爭性PCR試劑盒，屬于分子生物學檢測診斷領域。?

背景技術

唐氏綜合征(Down?Syndrome，DS)，又稱為先天愚型，是活產胎兒中最常見的染色體異常綜合征之一，其發病率約為1/600-1/800。DS的體征非常多樣，通常涉及多種組織器官的異常，但其最突出、最嚴重的臨床表現為精神發育遲滯。該病的主要臨床特征為：嚴重智力低下，且智力低下的表型隨年齡增長逐漸明顯，動作發育和性發育遲緩，基本無生活自理能力。具有獨特的面部和身體畸形、先天性心臟病、消化道畸形等，白血病的發病率也比人群平均發病率高10-30倍。患者的平均壽命在30歲左右。?

DS絕大多數都是偶發的，每個孕婦都有生患兒的可能，發病無明顯的種族差異和家族聚積現象。世界各地大量群體調查的結果表明種族之間發病率幾乎相同，唐氏綜合征的每個體細胞中21號染色體為3條，而其它常染色體為2條，淋巴母細胞或羊水脫落細胞體外培養和染色體制備觀察是其實驗室檢測的常規方法，該方法雖然準確度高，但技術復雜耗時長，不能實現自動化和高通量檢測。由于唐氏綜合征患者21號染色體上的單拷貝序列拷貝數是其它常染色體上的單拷貝序列拷貝數的1.5倍，而DSCR是唐氏綜合征發病的關鍵單拷貝序列區段，因此可以選擇21號染色體上的DSCR特異的單拷貝序列和常染色體上的特異單拷貝序列，通過熒光定量PCR技術來檢測出它們的相對拷貝數的比值來判斷21號染色體的倍性，從而對從微量DNA標本中檢測出唐氏綜合征具有重要現實意義。?

實時熒光定量PCR技術是近年來發展起來的能夠對特異DNA(基因)拷貝數進行精確定量的最先進的基因劑量定量新技術。其基本原理是在PCR反應體系中同時加入TaqMan?探針(特異寡核苷酸探針)，該探針的5’端標記了一條熒光報告基團(R)，而在這條寡核苷酸探針的3’端標記了一條熒光淬滅基團(Q)。當這條探針處于完整狀態或者沒有反應時，R所產生的一部分熒光將被Q吸收或淬滅。在PCR反應過程中，該探針可與PCR目標基因特異性雜交，然后被Taq?DNA聚合酶的5’外切活性降解，使R和Q分離，游離的R發出熒光信號被檢測。隨著PCR反應的進行，游離的R與PCR產物相對應的增加。因此，根據每個循環后R產生的熒光信號的強度，即可實時測量出PCR反應產物的數量。如果同時使用拷貝數已知的DNA標準品做標準曲線，即可對所檢測的標本的靶DNA做精確定量。?

發明內容

本發明目的在于建立一種操作簡便，能夠快速準確檢測唐氏綜合征患者的DCC-FQ-PCR試劑盒。?

本發明的技術方案是：該種DCC-FQ-PCR試劑盒，含有擴增21號染色體特異單拷貝區段DSCR和2號染色體特異單拷貝序列USC2的熒光定量PCR試劑，其特征在于，首先根據21號染色體特異序列DSCR區段序列和2號染色體上的與之有一定的同源性的特異單拷貝序列USC2分別合成其共用PCR引物和特異性雙色Taqman熒光探針，然后將0.2-0.4umol/LDSCR和USC2共用特異性引物、DSCR和USC2特異雙色熒光Taqman探針加入同一個PCR擴增緩沖反應體系中，在FTC2000實時熒光定量PCR儀上進行96℃預變性2min，然后94℃變性10sec，50-55℃復性30sec，60℃延伸40sec，共45個循環，并在60℃延伸時檢測熒光強度，使引物分別同時競爭性地引導DSCR和USC2兩種特異單拷貝DNA區段的新鏈合成，實現DCC-FQ-PCR擴增和其拷貝數的定量檢測。?

上述DSCR和USC2共用引物和特異雙色Taqman熒光探針的序列分別為：共用上游引物5’-AAA?GTT?TCT?TCT?GGA?TCT?ACA?G-3’(SEQ?ID?NO：1)；共用下游引物：5’-TCCTCT?GTG?CTC?TGA?GCT?AAG-3’(SEQ?ID?NO：2)；DSCR?TaqMan探針：5’-[FAM]ACA?TTTTGG?ATG?CAC?TGG?GA[TAMRA]-3’(SEQ?ID?NO：3)；USC2特異TaqMan探針：5’-[HEX]CAA?AAC?TCA?CAG?AGG?GAC?TC[TAMRA]-3’(SEQ?ID?NO：4)。?