[發明專利]一種組織工程人角膜內皮的重建方法

有效

• 申請號: 200910020034.6
• 申請日: 2009-03-23
• 公開（公告）號: CN101508971A
• 公開（公告）日: 2009-08-19
• 發明（設計）人: 樊廷俊;趙君;王晶;楊洪收;叢日山;于昊澤
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;A61L27/38;A61F2/14
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司
• 代理人: 張中南

技術領域

本發明涉及一種利用人角膜內皮細胞和脫上皮層羊膜重建組織工程人角膜內皮的方法。

背景技術

高等動物的角膜內皮在維持角膜透明、角膜厚度以及為角膜提供營養等方面具有不可替代的作用。角膜受到感染或手術等創傷后，將引起角膜內皮細胞發生不同程度的減少，一旦角膜內皮細胞密度低于維持角膜內皮生理功能的臨界密度，角膜內皮將出現不可逆之病變，形成角膜內皮盲。目前，我國約有角膜內皮盲患者80萬人，盡管他們可以通過角膜移植來治愈，但由于捐獻角膜的高度匱乏致使絕大多數患者因得不到移植角膜而無法重見光明。近年來，角膜組織工程的興起為組織工程角膜內皮的體外重建及其應用于角膜內皮盲的臨床治療帶來了新的希望，但如何利用角膜內皮細胞和適宜的載體支架在體外重建出組織工程人角膜內皮已經成為研究熱點。

利用對人角膜內皮的體外重建研究開始于1992年。此后，May?Griffith等(1999)利用癌基因轉染的永生化人角膜上皮細胞、基質細胞、內皮細胞與醛交聯膠原蛋白在體外成功重建出形態、透明度和組織結構與正常角膜大體相近的功能性人角膜組織類似物，為人角膜組織的體外重建開辟了道路，但由于所用角膜細胞均為轉染了癌基因、具有潛在致瘤性的永生化細胞，從而限制了其在人角膜內皮重建和臨床中的應用。2004年，日本學者Yutaka?Ishino等和Tatsuya?Mimura等利用體外培養至第4-5代的人角膜內皮細胞分別與去上皮層羊膜和膠原膜片分別重建出與正常功能接近的人角膜內皮細胞薄片。2007年，Jui-Yang?Lai等將取自眼庫成人角膜的人角膜內皮細胞原代培養在修飾后的N-(1-甲基乙基)-2-丙烯酰胺均聚物載體支架上獲得了近似于正常功能的人角膜內皮細胞薄片。2008年，日本東京大學醫學院Kouichiro?Hitani等又利用薄膜培養法獲得了近似于正常功能的人角膜內皮細胞薄片。這些研究結果為利用非轉染人角膜內皮細胞重建人組織工程角膜內皮開辟了道路，但由于所用種子細胞均為來源于眼庫角膜或在24孔培養板中原代培養或僅傳4-5代的人角膜內皮細胞，故細胞數量非常有限，所能重建出的組織工程人角膜內皮的數量極少，即使成功后能用于臨床角膜移植的數量也極其有限，故仍只限于實驗研究，更無法滿足我國約80萬、全世界1000余萬角膜內皮盲患者臨床治療的大量需要。

2005年，樊廷俊等在國際上首次成功建立了沒有任何致瘤性的非轉染人角膜內皮細胞系，成功解決了人組織工程角膜內皮規?；亟ㄋ璐罅糠N子細胞的來源問題。因此，盡早建立理想載體支架的制備技術，進而建立一種利用非轉染人角膜內皮細胞和理想載體支架重建組織工程角膜內皮的方法，已成為全世界眼科專家們的主攻目標，也是組織工程角膜內皮臨床應用以及造福全世界角膜盲患者的關鍵之所在。

發明內容

本發明的目的就是利用人角膜內皮細胞和脫上皮層羊膜載體支架，提供一種組織工程人角膜內皮的重建方法。

本發明的方法；取人角膜內皮細胞，用含20％小牛血清的DMEM/F12培養液在底面積25平方厘米培養瓶中置37℃擴增培養至對數生長期，用0.25％胰蛋白酶溶液消化和滴管吹打法懸浮細胞，離心收集細胞沉淀，用5毫升組織工程人角膜內皮重建專用培養液懸浮所得細胞沉淀制成人角膜內皮細胞懸液，經血球計數板計數后，用上述專用培養液調整細胞濃度至4.2×10⁶～4.2×10⁷個細胞/毫升。

然后，利用0.25％胰蛋白酶溶液對凍干羊膜的上皮面進行倒置消化，以得到完全脫去上皮層的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器將脫上皮層羊膜打成與培養板孔直徑相同的羊膜圓片，使其上皮面朝上平鋪于48孔培養板孔的底部，放置于5％CO₂培養箱中在37℃條件下牢固干貼后制成羊膜載體支架備用。

最后，在貼有脫上皮層羊膜載體支架的培養板孔中，輕輕加入上述準備好的人角膜內皮細胞懸液0.1～0.2毫升，使細胞懸液均勻分散于培養孔中，置5％CO₂培養箱中37℃培養20～24小時待細胞完全貼附到羊膜載體支架上后，補加上述專用培養液使其液面達到培養孔高度的3/4，待人角膜內皮細胞在羊膜載體支架上長成單層后即為重建的組織工程人角膜內皮。

本發明所用組織工程人角膜內皮重建專用培養液的配方為：DMEM/F12培養液，20％小牛血清，0.05％～0.1％IV型膠原蛋白；

為了提高人角膜內皮細胞在脫上皮層羊膜載體支架上的貼附效果，本發明又添加了0.05％～0.1％纖連蛋白。