[發明專利]一種從毛蚶中分離純化血紅蛋白的方法

無效

• 申請號: 200910020033.1
• 申請日: 2009-03-23
• 公開（公告）號: CN101508732A
• 公開（公告）日: 2009-08-19
• 發明（設計）人: 樊廷俊;張亞南;徐彬;荊昭
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C07K14/805
• 分類號: C07K14/805
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司
• 代理人: 張中南

技術領域

本發明涉及一種從毛蚶中分離純化血紅蛋白的方法。

背景技術

血紅蛋白是所有脊椎動物(包括人類)和部分無脊椎動物血液中所含 有的一大類含鐵的呼吸蛋白，除具有運輸氧氣的主要功能外，還具有穩定 血壓、抗菌、運輸硫化物、調節酸堿平衡、氧化酶、過氧化酶活性等多種 生物學功能，是最具有研究價值的蛋白質家族之一。

毛蚶(Scapharca?subcrenata)是隸屬于軟體動物門瓣鰓綱的一種具有 重要經濟價值的海洋無脊椎動物，其免疫反應比較原始、缺乏真正意義上 的抗體、沒有免疫記憶能力，只能依靠先天性免疫反應來抵御寄生蟲和疾 病。在其對生存環境中多種病原微生物的免疫防御反應中，血細胞起著決 定性的作用。同時，毛蚶的血淋巴中含有大量的血紅蛋白也具有抑菌活性 和類酚氧化酶活性等，在免疫防御反應中也承擔著重要功能，對毛蚶血紅 蛋白的研究對于揭示血紅蛋白在無脊椎動物中的多重生物學功能以及各種 呼吸蛋白之間的進化關系具有重要的科學價值，因而也引起了科學家們的 廣泛關注。毛蚶血紅蛋白的分離純化是開展毛蚶血紅蛋白多重生物學功能 研究的基礎和前提，但遺憾的是，至今仍未檢索到有關毛蚶血紅蛋白分離 純化技術方法的報道。

發明內容

本發明的目的就是建立一種從毛蚶中分離純化血紅蛋白的方法，以彌 補已有技術的不足，為研究其多重生物學功能奠定基礎。

首先，取新鮮毛蚶，經消毒過濾海水清洗后，將吸有預冷Alsever氏抗 凝劑的注射器插入毛蚶鰓部取血，所得血淋巴在4℃條件下經過離心收集血 細胞沉淀，用pH7.2的50mM?Hepes緩沖液將血細胞懸浮后，置-80℃和4℃ 反復凍融2～3次以破碎血細胞，在4℃條件下經8000～9000轉/分高速離心 后收集上清液，用Centricon-10濃縮離心管在4℃條件下濃縮至0.5毫升， 即為毛蚶血紅蛋白粗品。

在4℃層析柜中，將0.5毫升毛蚶血紅蛋白粗品上樣于已用上述Hepes 緩沖液預平衡2小時的Superdex?200(16mm×400mm)凝膠過濾柱進行第 一步柱層析純化，以流速0.5毫升/分進行洗脫，以1毫升/管的量分部收集 洗脫組分，檢測各洗脫組分在波長415nm的光吸收值，收集具有高吸收值 的洗脫組分，經Centricon-10濃縮離心管在4℃條件下濃縮至0.5毫升，再 上樣于已用上述Hepes緩沖液預平衡2小時的Sephacryl?S-100凝膠過濾柱 (16mm×400mm)進行第二步柱層析純化，以流速0.5毫升/分進行洗脫， 以1毫升/管的量分部收集洗脫組分，檢測各洗脫組分在波長415nm的光吸 收值，收集具有最高光吸收峰值的洗脫組分，即為毛蚶血紅蛋白純化樣品。

本發明方法簡便、重復性好且血紅蛋白的得率高，所純化的血紅蛋白 仍保持有四級結構和天然活性，便于進行其多重生物學功能研究。

具體實施方式

本發明給出詳細具體的分離純化方法。

1、取新鮮毛蚶1000克，放入盛有消毒過濾海水的玻璃缸中清洗2～3 次，用5毫升注射器吸入2毫升預冷Alsever氏抗凝劑(葡萄糖2.05克， 檸檬酸鈉0.8克，氯化鈉0.42克，用重蒸水定容至100毫升)，插入毛蚶鰓 部取血，抗凝劑與血淋巴的體積比始終保持在1∶1，放入50毫升離心管中， 混勻后在4℃條件下1500～2000轉/分離心20～25分鐘，小心吸出離心上清 液，加入1毫升pH7.2的50mM?Hepes緩沖液充分懸浮血細胞沉淀，放-80℃ 冷凍4小時后，取出離心管放在4℃使血細胞懸液融化，如此反復凍融2～3 次以破碎血細胞，最后將凍融后的血細胞懸液在4℃條件下8000～9000轉/ 分離心50～60分鐘，收集離心上清液，用Centricon-10濃縮離心管3000～4000 轉/分在4℃條件下濃縮至0.5毫升，即為毛蚶血紅蛋白粗品，用于下一步純 化。