[發明專利]中華絨螯蟹Crustin-2基因及其重組蛋白的應用

有效

• 申請號: 200910020030.8
• 申請日: 2009-03-25
• 公開（公告）號: CN101565703A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 宋林生;鄭沛林;母昌考;趙建民;王玲玲;邱麗梅;蓋云超
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;A61K38/17;A61P31/04;A23K1/16;A23L3/3526
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技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及中華絨螯蟹Crustin-2基因序列，具體地說是從中華絨螯蟹cDNA文庫中篩選出中華絨螯蟹Crustin-2相關的EST序列，并拼接成全序列，然后進行了Crustin-2的原核重組表達并進行了相應抗菌活性的鑒定。該發明涉及到Crustin-2基因及其表達產物在藥物生產、飼料添加劑以及防腐劑和保鮮劑生產中的應用。

背景技術

抗菌肽是廣泛存在于生物界中的雙親性小分子堿性多肽，是機體固有免疫的關鍵因子。Steiner最早在天蠶中發現后，到目前為止，在各種生物中總共發現了800多種抗菌肽。根據抗菌肽的序列、二級結構和抗菌特性等，將已發現的抗菌肽分為四大類：(1)不含半胱氨酸的線型抗菌肽，如天蠶素、馬蓋寧等；(2)具有半胱氨酸的環型抗菌肽，如防御素，抗真菌肽等；(3)富含某一種或兩種氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等；(4)由前體大分子酶解產生的抗菌肽，如鱟的血藍蛋白。Crustin作為一種針對革蘭氏陽性菌的抗菌肽，首先是在岸蟹中發現的(Relf?et?al.，1999)。隨后的研究發現其氨基酸序列在其C末端有12個Cys，其中8個位置保守，形成WAP結構域。

中華絨螯蟹(Eriocheir?sinensis)又名河蟹，因其營養豐富、味道鮮美而深受人們喜愛，是我國重要的水產養殖品種之一。自20世紀80年代以來，中華絨螯蟹養殖業發展迅速，到2000年全國養殖產量已超過100000t，年產值達120-150億元，已成為水產養殖支柱產業之一(崔朝霞等，2003)。但隨著中華絨螯蟹養殖規模的不斷擴大，各種疾病日趨嚴重，給養殖產業造成了巨大損失。養殖中華絨螯蟹病害的不斷爆發及病因的多樣性迫切要求從機體本身的免疫防御因子入手研究其抗病機制和制定新的疾病防治措施。Crustin作為一種重要的針對革蘭氏陽性菌的抗菌肽在其免疫防御中發揮著非常重要的作用。

發明內容

本發明的目的是從中華絨螯蟹中克隆Crustin-2，并對其進行原核重組表達及重組產物的活性鑒定，為進一步研究中華絨螯蟹疾病防御機制提供基礎，并為中華絨螯蟹的病害防治、基因輔助選育及進一步開發為醫藥產品和飼料添加劑奠定基礎。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

利用構建的cDNA文庫，采用RACE技術以及體外重組表達等技術，對中華絨螯蟹Crustin-2進行了研究，首次從中華絨螯蟹中克隆到Crustin-2，該基因如序列表中的序列所示。

本發明從中華絨螯蟹中克隆到Crustin-2基因cDNA全長1255bp，包含一個339bp的開放閱讀框，編碼112個氨基酸，5’非編碼區長30bp，3’非編碼區長886bp，有多聚腺苷酸加尾信號和多聚腺苷酸尾巴，該基因在中華絨螯蟹免疫防御方面發揮著重要作用。其序列由SEQID?NO.1所示。

其編碼的蛋白序列如SEQ?ID?NO.2所示，分子量為12369.06，等電點為6.76，其中編碼序列的1-19為信號肽序列，成熟肽分子量為10464.64，等電點為6.21。具有典型的WAP結構域。利用pET30a(+)表達載體在大腸桿菌origami(DE3)重組表達了該蛋白，表達產物對革蘭氏陽性菌具有明顯抑菌活性，如藤黃微球菌(Micrococcus?luteus)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、四聯球菌(Micrococcus?tetragenus)和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis)的最小抑菌濃度分別為0.093μM、0.19μM、0.37μM和0.093μM；而對革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌Escherichia?coli和鰻弧菌Listonella?anguillarum沒有殺菌活力。中華絨螯蟹Crustin-2基因的重組表達產物可作為動物飼料添加劑、食品防腐劑和食品保鮮劑。