[發明專利]利用pre-miR159a構建的抗病毒植物表達載體及其應用

無效

• 申請號: 200910019780.3
• 申請日: 2009-04-03
• 公開（公告）號: CN101519659A
• 公開（公告）日: 2009-09-02
• 發明（設計）人: 郭興啟;艾濤波;李善偉
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及分子生物學和生物技術領域，具體涉及了一種采用擬南芥pre-miR159a的克隆、改造、轉化以及轉基因制得的抗病毒載體。

背景技術

植物病毒病是農作物的主要病害，目前約有1000多種植物病毒病已被人們所認識。每年全世界的農作物因病毒侵害的損失高達200億美元，對農業生產構成了嚴重的威脅。因此，植物病毒病的防治早已是農業工作者關注和研究的重要對象。早期對病毒病的防治措施主要是栽培管理和傳統的抗病育種。通過改善栽培管理來增強植物的抗病性，這一措施只能是減輕植物的發病程度但不能從根本上解決植物病毒發生的問題；而傳統的抗病育種由于育種周期長，加之絕大多數植物缺少抗病毒基因或植物對某一病毒的抗性是一種多基因效應，很難通過傳統育種的方式獲得抗病毒植株，因此，通過傳統的育種方法來防治植物病毒病已遠遠無法滿足人們的要求。近年來，植物分子生物學和基因工程技術的發展給植物病毒病的抗病育種開辟了新途徑。利用病毒本身的一些基因或經改造合成的基因轉入受體植物中去，可獲得抗病毒的轉基因植株。最早獲得成功的是使用病毒外殼蛋白基因(CP)，這一策略是使轉CP基因在植株內表達，干擾病毒的正常增殖環節，從而達到抗病目的。此外，利用病毒的復制酶基因、運動蛋白基因轉化植物也是植物抗病毒基因工程的重要策略，并已成功地應用于一些病毒病的防治中。早期的研究大多是通過表達病毒的蛋白質來實現抗病的，轉基因序列表達蛋白量的多少直接影響著抗性水平的高低，因此這類抗性常稱作蛋白質介導的抗性。其主要特征是抗性水平與轉基因的蛋白質表達量成正相關。但是，隨著研究的深入，與蛋白質介導的抗性特點相背的例子逐漸增多，甚至在無翻譯起始密碼子的情況下，轉基因仍可以賦予植物抗性，這是不同于蛋白質介導抗性的另一種抗病類型，即RNA介導的病毒抗性。

在植物抗病毒基因工程育種中，RNA介導的病毒抗性是同源依賴的抗性，即轉入的病毒基因在細胞核內正常轉錄或高水平轉錄，轉基因mRNA轉運到細胞質后與同源的入侵病毒核酸發生堿基互補，形成雙鏈核酸，然后被寄主內的核酸酶所降解，轉基因發生了RNA沉默，而入侵病毒則不能進一步復制，從而賦予轉基因植物對特異病毒的抗性。在這一過程中轉基因植物發生的RNA沉默是由于病毒入侵轉基因植物所導致的，因此又稱這類RNA沉默為病毒誘導的RNA沉默。另一種是在沒有病毒侵染的情況下轉入的病毒基因發生了RNA沉默，即由于轉基因插入方式的不同、轉基因高拷貝的存在、轉基因插入位點等造成了轉基因高水平轉錄，形成了大量異常RNA，這些異常RNA很容易被寄主內的RNA依賴的RNA聚合酶所識別，然后以異常RNA為模板，轉錄形成雙鏈RNA，進一步被寄主體內的核酸酶降解，轉基因發生了RNA沉默。當同源的病毒入侵時，病毒的核酸被細胞內已經發生的RNA沉默機制所降解，病毒不能復制，轉基因植物表現為對特異病毒的抗性。這類RNA沉默稱之為轉基因誘導的RNA沉默。研究發現，無論是病毒誘導的RNA沉默還是轉基因誘導的RNA沉默，直接導致RNA沉默發生的是小分子干擾RNA(small?interference?RNA，siRNA)。因此，將上述兩類RNA沉默介導的病毒抗性統稱為siRNA參與的RNA沉默介導的病毒抗性。在植物抗病毒工程中這一策略得到了廣泛地運用，獲得了大量抗病毒的轉基因植物。但是，隨著研究的深入人們發現這一策略存在著一些弊端，主要體現在三個方面：第一，siRNA的產生和傳播受寄主植物內一些酶活性、環境溫度的變化和病毒抑制子等相關因素的影響。如這類轉基因植物的病毒抗性往往因溫度的降低而抗病性喪失、能產生沉默抑制子的病毒入侵，通過抑制RNA沉默而打破了轉基因植株的抗病性。第二，這一策略需要完整的病毒基因或較長的病毒cDNA片斷，而長片斷在植物中如果沒有足夠大的同源性則容易造成脫靶，不會發生RNA沉默，轉基因植物就不會產生抗病毒作用。第三，轉入長的病毒cDNA片斷存在著與其他入侵病毒或寄主植物的基因組發生重組的風險，轉基因植物的安全性得到一定程度的質疑。因此，在目前研究的基礎上很有必要探討更有效的植物抗病毒育種新策略。