[發明專利]一種糖基功能化細菌毒素分子印跡柱的制備方法及應用

無效

• 申請號: 200910018457.4
• 申請日: 2009-09-29
• 公開（公告）號: CN101666752A
• 公開（公告）日: 2010-03-10
• 發明（設計）人: 黃加棟;于京華;汪世華;裴梅山;葛慎光;邢憲榮;賀曉蕊;林青;張秀明;朱晗;孫納新;宋曉妍;袁靚
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所
• 代理人: 李桂存

技術領域

本發明涉及一種糖基功能化細菌毒素分子印跡柱的制備方法，本發明還涉及采用所述的糖基功能化分子印跡柱檢測樣本中細菌毒素的方法，屬于細菌毒素檢測技術領域。

背景技術

細菌毒素主要有三種：外毒素、內毒素和非蛋白毒素。外毒素是一種典型的水溶性蛋白，是細菌在指數生長期分泌的已知可感染人類毒性最強的細菌毒素，在很低濃度時就具有很高的毒性。隨著檢測方法和分析技術的發展，人們發現細菌毒素幾乎廣泛存在于所有的食品和飼料中。因此，開發一種準確度高、特異性強、快速檢測細菌毒素的方法，對食物中毒、水污染等突發事故作出快速診斷，并選擇合適的應對措施，對于食品與環境控制以及國防安全都是十分重要的。細菌毒素的存在會威脅人類健康，造成社會經濟損失，因此，細菌毒素的預防、去毒、解毒，尤其是快速高靈敏度的檢測方法的建立顯得十分重要。

細菌毒素的檢測分析方法主要有生物學方法，如：動物測毒法和細胞測毒法；免疫學方法，如：有反向被動血凝實驗(RPHA)、被動免疫溶血試驗(PIH)、毒素與抗毒素瓊脂擴散試驗、放射免疫測定(RIA)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)；分子生物學方法，如：PCR法。這些檢測方法雖然靈敏度較高，穩定性較好，但大多都有周期長，過程復雜，費時費力結果準確性等缺點。

由于大多數細菌毒素的類似物較多、新發現的細菌毒素不斷增加、細菌毒素污染的普遍性和危害性被逐步認識等原因，對細菌毒素的快速高靈敏度分析方法也提出了更迫切和更高的要求。目前，限制細菌毒素檢測研究的難點主要是：結構相似物較多，交叉反應普遍；毒素檢測時較易受提取液中其它難于去除的干擾物質的影響等。針對當前細菌毒素危害性大、檢測困難、不易預防等特點，尤其對商檢和衛生防疫部門來說，更需要有一個簡便、快速、靈敏的方法對細菌毒素進行檢測，對其潛在危害作出判斷，以促進經濟發展，保障人類健康。

發明內容

針對現有技術中存在的不足，本發明提供了一種糖基功能化細菌毒素分子印跡柱的制備方法。

本發明還提供了采用所述的糖基功能化分子印跡柱檢測樣本中痕量細菌毒素的方法，可實現對細菌毒素簡便、快速、準確的檢測。

本發明是通過以下技術方案實現的：

所述的糖基功能化細菌毒素分子印跡柱的制備方法，包括以下步驟：

(1)選擇能與細菌毒素合成糖基功能化分子印跡聚合物的糖類化合物功能單體；

(2)將模板分子細菌毒素、功能單體糖類化合物、交聯劑、致孔劑、引發劑和有機溶劑按一定摩爾比混合均勻制成糖基功能化分子印跡聚合物溶液；

(3)利用表面修飾技術，將糖基功能化分子印跡聚合物修飾到玻璃管柱內表面上。

所述模板分子細菌毒素、功能單體糖類化合物、交聯劑、致孔劑、引發劑和有機溶劑的摩爾比為0.1～2∶2.5∶0.1～5∶40～80∶0.01～0.10∶1.0～15。

所述糖類化合物功能單體為A-D-吡喃糖基甘露糖、N-乙酰糖胺、N-乙酰乳糖胺、唾液酸神經節苷脂或神經酰胺三己糖苷；所述交聯劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、N、N-亞甲基二丙烯酰胺、3，5-二(丙烯酰胺)苯甲酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯或季戊四醇三丙烯酸酯；所述引發劑為偶氮二異丁腈；所述致孔劑為二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、異丙醇、四氯化碳、N，N-二甲基酰胺或二甲基亞砜；所述有機溶劑為二氯甲烷或四氯化碳。

所述將糖基功能化分子印跡聚合物修飾到玻璃管柱內表面包括以下步驟：

(1)選用長度為5-10cm，直徑為2-10mm的玻璃管柱，依次用1mol/L?HNO₃和1mol/LNaOH清洗，然后用雙蒸水徹底清洗數次，吹干；

(2)向玻璃管柱中注入糖基功能化分子印跡聚合物溶液，填滿，將玻璃管柱兩端封閉，浸泡5-10min，然后將玻璃管柱中的糖基功能化分子印跡聚合物溶液排出，用洗脫劑洗脫20-30min，室溫下干燥5-10min；

(3)重復步驟(2)過程4-7次，制得所述糖基功能化分子印跡柱。

為除去玻璃管柱內表面過量的糖基功能化分子印跡聚合物，本發明所述的制備方法，還包括以下步驟：將糖基功能化分子印跡柱浸入pH6.8-7.2緩沖液中，保存在4℃冰箱，12～24h后使用。

所述洗脫劑為乙腈、水、甲醇-乙酸混合液或乙腈-乙酸混合液。所述緩沖液為檸檬酸-磷酸溶液。

本發明所述的檢測細菌毒素的方法，是將按上述的任意一種方法制得的糖基功能化分子印跡柱連接到化學發光分析儀，將化學發光體系溶液與樣品溶液分別泵入化學發光分析儀，對樣品中的細菌毒素進行檢測。