[發明專利]辣椒疫霉菌果膠甲基酯酶Pcpme1基因分子檢測技術

無效

• 申請號: 200910018359.0
• 申請日: 2009-09-10
• 公開（公告）號: CN101643783A
• 公開（公告）日: 2010-02-10
• 發明（設計）人: 張修國
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體地說，本技術發明提供從來辣椒疫霉菌的果膠甲基酯酶Pcpme?1基因設計并合成的一對特異引物，并提供檢測辣椒疫霉特異性和靈敏度的證據。此外，本發明主要涉及利用該技術對辣椒病田土壤、病莖、病葉、病果中的辣椒疫霉菌進行定性、定量分子檢測和疫情發生趨勢的預警，對辣椒疫病適時進行綜合防控和高效治理。

背景技術

植物病原卵菌是一類重要的植物病原菌，可侵染危害多種植物，導致多種植物的毀滅性病害，如致病疫霉(Phytophthora?infestans)、辣椒疫霉(P.capsici)、大豆疫霉(P.sojae)、寄生疫霉(P.parasitic)、樟疫霉(P.cinnamomi)及冬生疫霉(P.hibemalis)分別引起馬鈴薯、辣椒、大豆、煙草、樟樹及柑橘的重要疫病，嚴重年份乃至絕產。該類病菌主要以菌絲體或卵孢子在病殘體或土壤中度過不良環境而作為初侵染源，在適宜條件下，菌絲體或卵孢子均可萌發產生孢子囊-釋放游動孢子，再借助雨水或氣流進行傳播、侵染而導致植物病害。因此，對該類病菌的初侵源或侵染寄主早期進行適時檢控，利于控制病害的發生。傳統的病害防控策略主要依靠品種、栽培、化防和生態調控等防治措施，這些防控措施主要在病害爆發乃至產生明顯危害時才實施，忽視了對初侵染源或侵染寄主早期適時采取綜合防控和高效治理措施，近而事半功倍，防效甚微，最終很難控制病害的發生與流行。

近年來，PCR技術及其相關分子檢測技術已廣泛用于植物病原菌消長動態的分子檢測與預警，其中主要利用核糖體rDNA/ITS序列設計特異引物，已針對性的開展了大豆疫霉、致病疫霉、冬生疫霉、寄生疫霉、辣椒疫霉的分子檢測技術研究，但這些技術性研發成果僅能對病菌活動動態進行檢測與預警，但不能對病菌致病特性與發生趨勢進行檢測與預警。研究標明疫霉菌-寄主互作過程中常分泌多種重要的細胞壁降解酶，主要包括多聚半乳糖醛酸酶(Pg)、果膠甲基酯酶(Pme)、果膠裂解酶(Pel)，它們主要通過降解或軟化植物細胞壁的主要成分果膠、中膠層及果膠聚合體，而促使病菌的侵入與定植，對寄主產生寄生與致病性。該類致病酶是均由多基因編碼，其中少數關鍵基因是重要的致病靶基因，因此分離鑒定這些重要致病酶的靶標基因，利用基因信息學設計并合成靶標基因的特異引物，針對病菌不同時期的致病特性進行分子檢測與預警，以便在病菌初侵染期適時采取綜合防控措施，減少藥劑使用次數與使用量，阻斷病菌的擴展與蔓延，控制病害的發生與蔓延。因此，開展重要疫霉菌致病酶類靶標基因克隆及其特異引物設計與合成，研制病菌分子檢測、預警技術及其試劑盒，對重要疫霉病的綜合防控具有重要的理論與實踐意義。本發明以辣椒疫霉為參試材料，通過解析辣椒疫霉果膠甲基酯酶基因簇成員組成，將Pcpme?1界定為靶標致病基因，設計并合成Pcpme?1基因的特異引物，驗證其特異性和靈敏度，借助PCR技術對辣椒疫霉活動動態及致病特性進行定性、定量分子檢測與預警。在本發明申請之前，從世界范圍內除利用辣椒疫霉rDNA/ITS序列特異引物對該病菌進行分子檢測外，無任何利用重要致病酶類的靶標基因特異引物對辣椒疫霉消長動態進行分子檢測與病情預警的資料信息。

發明內容

1、在界定辣椒疫霉菌果膠甲基酯酶靶標致病基因Pcpme?1的基礎上，通過基因信息比對，本發明設計并合成了Pcpme?1基因的一對特異性引物，提供了利用該對特異引物對辣椒疫霉消長動態及致病特性進行定性、定量分子檢測的操作技術。先對所有參試種菌進行PCR特異性擴增，驗證其特異性，然后對土壤卵孢子和游動孢子進行定量分子檢測，進一步驗證其靈敏度，證明了該對引物可對不同時期的辣椒疫霉進行定性、定量分子檢測。在此基礎上，利用PCR檢測技術對辣椒病田土壤、辣椒疫病組織(病莖、病葉、病果)疫霉菌進行定性、定量分子檢測。因此，利用該對引物可對辣椒疫霉初侵染源及其侵染過程的各個時期病菌消長動態進行檢測與預警，本技術發明的應用推廣，便于選擇最佳有效防控時期，降低了病害防控成本，實施綜合防控與高效治理。

本發明所提供的果膠甲基酯酶Pcpme?1基因的一對特異性引物，上游引物為1RTF，含17bp，其序列如Seq?ID?No：2所示；下游引物為1RTR，含20bp，其序列如Seq?ID?No：3所示，該對引物擴增目的基因片段長度為287bp。該對引物序列與JGI中的jgi/phycaf7/20609中適宜對疫霉菌進行分子檢測的引物序列比對，未發現一個與其完全相同序列的引物，因此是一對新的辣椒疫霉分子檢測與預警引物。