[發(fā)明專(zhuān)利]干海參的分子生物學(xué)鑒別方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910015703.0
• 申請(qǐng)日: 2009-05-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101659993A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-03-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董云偉;孟憲亮;紀(jì)婷婷;董雙林;岳欣;王青林;田相利;王芳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)海洋大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 北京市德權(quán)律師事務(wù)所
• 代理人: 王建國(guó)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種包含酶或微生物的測(cè)定或檢驗(yàn)方法，具體涉及一種干海參的分子生物學(xué)鑒別方法。

背景技術(shù)

海參在分類(lèi)學(xué)上屬于棘皮動(dòng)物門(mén)，海參綱，極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，國(guó)內(nèi)主要的養(yǎng)殖品種為仿刺參(Apostichopus?japonicus)，干仿刺參是消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)的主要產(chǎn)品。隨著人們生活水平的提高，海參需求量大幅上升，產(chǎn)品鑒定成為急需解決的關(guān)鍵性技術(shù)問(wèn)題。目前我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)了多種海參，包括從日本引進(jìn)的紅刺參(Apostichopus?japonicus)，新西蘭海參(Australostichopus?mollis)，黑乳海參(holothuria?nobilis)，黃乳海參(holothuriafuscogilva)等。不同種的干海參之間價(jià)格差距比較大，但海參在經(jīng)過(guò)多道工序加工成干品之后，很難從外部形態(tài)上分辨其種類(lèi)。而缺乏有效的鑒別方法，導(dǎo)致市場(chǎng)流通比較混亂。

分子生物學(xué)技術(shù)給這一問(wèn)題提供了很好的解決辦法，CO?I基因序列在生物物種中非常保守，被廣泛應(yīng)用于物種的分類(lèi)和進(jìn)化研究。利用其在不同物種之間存在的核酸序列差異，使用限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，可以產(chǎn)生不同長(zhǎng)度和數(shù)量的核酸片段，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳即可分辨出不同種類(lèi)。此方法在我國(guó)干海參鑒定中還未見(jiàn)有公開(kāi)報(bào)道，這將為干海參鑒定提供科學(xué)的方法，對(duì)規(guī)范干海參市場(chǎng)提供技術(shù)支持。

公告號(hào)：CN?101130815A，公告日：2008.02.27的中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)公布了“華南沿海七種蠣屬牡蠣的PCR-RFLP鑒別方法”介紹了一種用于鑒定牡蠣的分子生物學(xué)方法，該發(fā)明方法設(shè)計(jì)的牡蠣聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物序列為：

CO?I?L1：5’-CGGTGTTTATCAAAAACAT-3’；

CO?I?H：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’.

利用限制性內(nèi)切酶Nis?I/Alu?I和Nis?I/Dde?I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，判定結(jié)果。該發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)牡蠣的快速、準(zhǔn)確地鑒別。但是該鑒別方法卻不能用于干海參的鑒別上。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有干海參形態(tài)學(xué)鑒別不準(zhǔn)確，科學(xué)鑒別技術(shù)普遍缺乏的不足，提供了一種科學(xué)有效、簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確的干海參的分子生物學(xué)鑒別方法。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的：干海參的分子生物學(xué)鑒別方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)采用高鹽法提取干海參DNA；

(2)利用簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增CO?I基因片段；

(3)用限制性內(nèi)切酶Csp6?I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切；

(4)對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過(guò)電泳條帶的數(shù)量和長(zhǎng)度判定結(jié)果。

步驟(1)所述高鹽法提取DNA的步驟是：

①取干海參100-200mg，在Milli-Q水中浸泡5-6小時(shí)，在液氮中研磨成粉末；

②轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，加入10ml提取緩沖液，其組成為50mM?Tris，100mM?NaCl，150mM?EDTA，1％SDS，0.30mg/ml蛋白酶K，0.1％巰基乙醇，pH?8.0，65℃消化3h；

③緩慢加入3ml?6mol/L?NaCl，鹽析除去多余的蛋白及多糖，4℃10000rpm離心10分鐘，收集上清液；

④加入等體積比例為25∶24∶1的酚、氯仿、異戊醇，15000rpm離心10分鐘，收集上清液；

⑤加入預(yù)冷的0.6倍體積的異戊醇，-20℃沉淀1-2h，室溫放置15min后，15000rpm離心3分鐘，去上清，收集DNA沉淀，用濃度為70％乙醇洗滌沉淀，在超凈臺(tái)放置5-10分鐘吹晾干，溶于200ul?TE緩沖液中。

步驟(2)所述的PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括下列步驟：

①聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的體系為25μl，各種試劑的用量分別為：

10×PCR緩沖液??????2.5μl

MgCl₂?25mM?????????1.6μl

dNTP?2.5mM?????????2.0μl

COIf?15μM?????????1μl

COIr?15μM?????????1μl

Taq酶5U/μl????????0.125μl

上部提取的DNA??????1μl

PCR級(jí)水????????????15.775μl

②聚合酶鏈?zhǔn)矫阜磻?yīng)在PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：

94℃預(yù)變性5分鐘，然后按以下條件反應(yīng)35個(gè)循環(huán)反應(yīng)：