[發明專利]一株用于好氧發酵的大腸桿菌工程菌株

無效

• 申請號: 200910015399.X
• 申請日: 2009-06-04
• 公開（公告）號: CN101613669A
• 公開（公告）日: 2009-12-30
• 發明（設計）人: 祁慶生;康振
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/46;C12P7/56;C12P13/14;C12P13/00;C12P7/42;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司
• 代理人: 王緒銀

技術領域

本發明涉及一株用于好氧發酵的大腸桿菌工程菌株E.coli?Q10(CCTCC?M?209113)，屬于基因工程和微生物發酵領域。?

背景技術

大腸桿菌作為一種模式生物，由于其遺傳背景清楚、操作技術成熟等特點，已經廣泛應用于遺傳、代謝工程等諸多領域。諸多外源性蛋白已經成功在大腸桿菌中表達并生產。通過基因工程改造大腸桿菌，諸如琥珀酸發酵、聚羥基脂肪酸發酵、谷氨酸發酵及乳酸發酵等途徑已成功構建。?

大腸桿菌雖然應用廣泛，但存在許多缺點。如乙酸鹽的分泌就是一個利用大腸桿菌發酵中常常面臨的問題。當外界環境中存在高濃度的葡萄糖等碳源時，大腸桿菌由于代謝不平衡而分泌大量的乙酸鹽。乙酸鹽的分泌不僅造成了碳源的浪費，同時乙酸鹽對菌體的生長有抑制作用，因而乙酸鹽的分泌不利用菌體的正常生長和發酵的進行。?

大腸桿菌中存在兩條主要的乙酸生成途徑。一條是丙酮酸通過PoxB(丙酮酸氧化酶)的催化生成乙酸；另一條途徑則是乙酰-CoA通過Pta(磷酸轉乙酰基酶)和ackA(乙酸激酶)生成乙酸，同時生成ATP。上述兩條途徑作用時間不同，大腸桿菌在時空上通過調節相關酶類來調節乙酸的生成速率。PoxB途徑主要在大腸桿菌進入穩定期后發揮作用；而Pta-ackA途徑則主要是大腸桿菌在對數生長期時發揮作用。?

當前有兩種方法已經應用于減少乙酸鹽的分泌。一種是對發酵工藝的優化，即通過控制葡萄糖等碳源的濃度來減少乙酸的分泌。雖然該方法可以減少乙酸的生成，但是延長了發酵周期。而另一種方法則是通過代謝工程手段，即阻斷乙酸生成分泌的直接途徑，減少乙酸的生成。然而過去的相關研究文獻只是針對個別乙酸相關基因進行單獨研究。而在大腸桿菌代謝途徑及其調控方式的基礎上構建同時缺失ptsG、poxB和pta基因的工程菌株的研究和專利還未見報道。?

發明內容

針對大腸桿菌發酵過程中所存在的乙酸鹽分泌問題，本發明目的是通過基因工程，利用基因敲除構建一株應用于好氧發酵的大腸桿菌工程菌株。同時，利用該工程菌株積累聚羥基脂肪酸酯(PHA)，本發明以PHA家族中的代表聚-β-羥基丁酸酯(PHB)為例來闡述該工程菌株的應用。?

本發明所述用于好氧發酵的大腸桿菌工程菌株，其特征在于：該菌株名為埃希氏大腸桿菌Q10，即為大腸桿菌Q10(Escherichia?coli?Q10)；菌株已于2009年5月27日保藏在“中國典型培養物保藏中心”，保藏編號為CCTCC?M?209113。?

上述大腸桿菌工程菌株Q10外形呈桿狀，大小為0.4～0.6微米×1～3微米，無芽胞。有普通菌毛與性菌毛，屬于革蘭氏陰性桿菌。此菌合成代謝能力強，在含無機鹽、胺鹽、葡萄糖的普通培養基上生長良好。最適生長溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長，生長溫度范圍為15-46℃。菌株的基因型為MG1655ΔptsGΔpoxBΔpta::Cm。?

上述大腸桿菌工程菌株的出發菌株是大腸桿菌MG1655、DH5a、JM109、W3110、XL1-Blue中的一種，其中優選菌株為大腸桿菌MG1655。所述MG1655、JM109和W3110購買于ATCC(美國典型菌種保藏中心)；DH5a與X11-blue購買于DSMZ(德國微生物保藏中心)。真養產堿桿菌(Alcaligenes?eutrophus)購買于CICC(中國工業微生物菌種保藏管理中心)。?

上述大腸桿菌工程菌株是通過敲除ptsG、poxB及pta基因而構建，其基因型可以由MG1655ΔptsG、MG1655ΔpoxB、MG1655Δpta、MG1655ΔptsGΔpoxB、MG1655ΔpoxBΔpta或MG1655ΔptsGΔpta基因型進一步改造獲得。?

上述大腸桿菌工程菌株的構建及檢測步驟是：?

(1).ptsG基因的敲除?

通過Red重組系統在大腸桿菌MG1655中敲除基因ptsG(磷酸轉移酶系統II)。所得缺失ptsG基因的大腸桿菌MG1655ΔptsG::Cm命名為E.coli?Q8。?

(2).poxB基因的敲除?

通過Red重組系統在大腸桿菌E.coli?Q8中敲除基因poxB(丙酮酸氧化酶)。所得缺失poxB基因的大腸桿菌MG1655ΔptsGΔpoxB::Cm命名為E.coli?Q9。?

(3).pta基因的敲除?