[發明專利]人轉錄因子HMBOX1基因的應用

無效

• 申請號: 200910015259.2
• 申請日: 2009-05-15
• 公開（公告）號: CN101555486A
• 公開（公告）日: 2009-10-14
• 發明（設計）人: 田志剛;吳龍妍;張建
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A61K48/00;A61P35/00;A61P37/06
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司
• 代理人: 程凌軍

技術領域

本發明涉及人轉錄因子HMBOX1基因的應用，特別是HMBOX1基因過表達后對自然殺傷細胞調控的應用，屬于功能基因組學技術領域。

背景技術

自然殺傷(NK)細胞是三大類淋巴樣細胞之一，屬于天然免疫系統，一直被譽為是機體抗癌、抗病毒的前哨，而且活化的NK細胞還可以通過分泌細胞因子等方式，來調節其他細胞的特異性和非特異性免疫反應，因此又被稱為連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。NK細胞的活化與否，以及其后續的功能活性，是由其表達的活化性受體和抑制性受體所決定，例如最重要的NKG2家族，目前對NK細胞受體的功能研究較多，但是至今有關NK細胞受體表達調控的機制尚未得到闡明。

HMBOX1(homeobox?containing?1)基因位于人染色體8p12.3和8p21.1的交界處，全長1263bp，是homeobox家族成員之一。由其經典的Homeobox?DNA結合結構域和報告基因實驗初步預測為轉錄抑制因子。該家族其他成員在NK細胞的發育成熟過程中起關鍵作用。但HMBOX1的具體功能尚未見報道，屬于新的功能未知蛋白。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種人轉錄因子HMBOX1基因及其編碼蛋白的應用。并以NK細胞的功能實驗為基礎，闡明人轉錄因子HMBOX1在NK細胞中的功能。由于其所在蛋白家族的重要性，對HMBOX1具體功能的研究，不僅揭示這個新基因的功能，而且為進一步了解NK細胞發育和功能調節過程奠定基礎。

發明概述

本發明利用分子克隆方法構建HMBOX1基因真核過表達載體。通過電轉方法將質粒導入NK細胞，經G418篩選建立穩定的NK-HMBOX1過表達細胞株。應用MTT法、流式細胞術、Real-time?PCR技術，分別對NK細胞的增殖、殺傷、脫顆粒能力以及活化/抑制性受體、細胞因子和殺傷顆粒表達水平進行檢測。研究HMBOX1對NK細胞的功能調節作用。

發明詳述

人轉錄因子HMBOX1基因在調控自然殺傷(NK)細胞功能方面的應用，通過如下步驟構建過表達載體，并使過表達載體表達來實現：

(1)HMBOX1基因cDNA克隆及過表達載體構建：

提取NK-92細胞的RNA，逆轉錄成cDNA，擴增HMBOX1?cDNA全長1263bp，設計引物，引物設計時根據pcDNA3.1-myc/his(-)載體說明書，起始密碼子前加KOZAK序列增強蛋白表達，終止密碼子由TAA點突變為TGA，使后續的myc和his標簽能正常表達。PCR擴增，PCR產物凝膠回收后，連接入T載體，經測序證明序列完全正確；然后用限制性內切酶BamHI和EcoRI將全長片段切下，凝膠回收后鏈接到pcDNA3.1-myc/his(-)載體上，經測序驗證，即得HMBOX1基因過表達載體pcDNA3.1-HMBOX1，序列如SEQ?ID?NO.1所示；(圖1)

(2)Western?blot鑒定HMBOX1表達載體在HEK293中的表達：

將步驟(1)制得HMBOX1基因過表達載體pcDNA3.1-HMBOX1通過脂質體Liptofectamin2000轉染入HEK293細胞中，24小時后提取細胞總蛋白，并做SDS-PAGE和Western?blot，用抗標簽蛋白myc抗體檢測HMBOX1蛋白的表達。(圖2)

上述步驟(1)中的引物序列為：5’CGGCTAGCGCACCATGGCGATGCTTAGTTCCTTTCCAGTG?3’和5’CCGAAGCTTGAGTCATCATCCAGGGCCT?3’。

上述步驟(1)中的PCR擴增，反應條件如下：95℃，5分鐘，1個循環；94℃，1分鐘，60℃，1分鐘，72℃，90秒，35個循環；72℃，10分鐘，1個循環。

經檢測上述表達載體在NK細胞中過表達后不影響NK細胞的增殖(圖4)。

經檢測上述表達載體在NK細胞中過表達后，NK細胞對靶細胞HepG2和K562的殺傷能力顯著下降，NK細胞的脫顆粒能力也明顯下降(圖5、6)。

經檢測上述表達載體在NK細胞中過表達后，NK細胞表面活化受體NKG2D表達下降，并且NKG2D和其接頭蛋白DAP10的mRNA水平也有下降。但NK細胞表面表達的其他殺傷相關受體NKG2A、CD54、FasL、NKp46、TRAIL沒有明顯變化(圖7、8、9)。

經檢測上述表達載體在NK細胞中過表達后，NK細胞表達細胞因子TNF-α和IFNγ的mRNA水平下降，IFNγ的蛋白水平下降顯著(圖10、11)。