[發明專利]沙冬青抗寒基因AmEBP1

無效

• 申請號: 200910015183.3
• 申請日: 2009-05-20
• 公開（公告）號: CN101892242A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發明（設計）人: 馮殿齊;王斌;劉靜;曹鵬秀;翁曼麗
• 申請（專利權）人: 泰安市泰山林業科學研究院;王斌
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C12N15/54;C12Q1/68;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發明涉及一種我國西北荒漠地區的源于遠古第三紀的國家二級瀕危保護植物，也是至今在亞洲中部荒漠地帶唯一保留下來的常綠闊葉木本植物沙冬青的抗寒基因AmEBP1的分子克隆和遺傳轉化。通過低溫誘導和差異表達分析，獲得了低溫誘導上調表達的沙冬青抗凍基因的EST片段，然后通過RACE擴增獲得了沙冬青抗寒基因AmEBP1的全長cDNA序列，在基因庫中進行了注冊，注冊為DQ519359。AmEBP1含有完整的ORF區域，ORF全長1188個核苷酸，編碼395個氨基酸和一個終止密碼子(TGA)。隨后構建了沙冬青抗寒基因AmEBP1的真核表達載體pCAMBIA2300-AmEBP1，用于轉化擬南芥和林木，獲得的轉基因植株抗寒性有所提高。AmEBP1是國際上克隆并完成遺傳轉化驗證的第一個木本植物抗寒基因，我們擁有完全獨立自主的知識產權。它的克隆和成功轉化對于木本植物抗寒基因研究和遺傳育種具有重要意義。?

二、背景技術

低溫是限制植物的生長，發育和分布的重要因素，2007-2008年在我國南方大面積發生的那場凍害，我們還記憶猶新，其中對木本植物造成的危害最重，而且其影響將持續在其后十幾年。木本植物抗寒基因的研究落后于草本植物，更落后于原核生物及魚類和昆蟲。但從另一個角度來看，由于木本植物具有相同的多年生的特性，具有木質化構造，冬季能夠發展出較強的抗寒性，所以從木本植物中應該更容易分離到有較強抗寒效果的基因。把這樣的基因轉化到需要的木本植物中可能會比轉化來自于其它生物的抗寒基因更為有效。所以從木本植物中克隆抗寒基因并研究它們的表達和功能，具有重要的理論意義和應用價值。?

植物抗寒基因工程與其它抗性基因工程相比起步晚，發展慢，直到八十年代末，才報道了抗寒基因工程方面的研究成果。至今，植物抗寒基因工程主要通過以下五個途徑進行：①魚類及昆蟲抗凍基因途徑；②脂肪酸去飽和代謝關鍵酶基因途徑；③超氧物岐化酶(SOD)基因途徑；④糖類基因途徑；⑤本草植物抗凍基因途徑。其中用的最早的是魚類抗凍基因途徑，魚類抗凍蛋白(AFPS)吸附于凍晶上，使極地魚類有抗冰晶化作用，保護極地魚。1989年，Cutler用極地魚黃鰈抗凍蛋白處理植物組織，明顯改善了馬鈴薯、草菁和擬南芥屬葉子的抗寒性能。George把人工合成的黃蓋鰈AFP基因，通過電激法成功導入玉米原生質體，得到表達。Sallis以農桿菌介導，把合成的PHA-AFP(植物凝集素PHF)轉入到馬鈴薯中，馬鈴薯的抗凍與耐凍能力提高了。近年來植物抗凍基因的研究有了較好的進展，美國和中國的科學家分別克隆了擬南芥的抗凍基因并導入番茄，得到良好的表達，獲得了抗寒性提高的轉基因植株。美國DNA植物技術公司把抗凍基因導入到蕃茄中，培育出耐寒蕃茄，并且認為抗凍蛋白有可能應用于所有蔬菜?品種的改良。但木本植物抗寒基因的克隆和轉化方面迄今尚未見成功報道。本研究結果正是希望在這個領域打開突破口而開展起來的。?

三、發明內容

本研究用我國西北荒漠地區一種常綠闊葉的豆科灌木沙冬青為材料，進行了木本植物冷誘導基因的克隆和功能分析研究。通過低溫誘導處理和差異表達分析，獲得了低溫誘導上調表達的沙冬青抗凍基因的EST序列十三個(包括八個全長基因和五個cDNAs的部分序列)。其中的一個(基因庫注冊號DQ519359)包含沙冬青抗寒基因ErbB3結合蛋白基因(the?geneencoding?ErbB3?binding?protein?of?Ammopiptanthus?mongolicus)的全長cDNA序列，命名為AmEBP1，其ORF區域長1188個核苷酸，編碼395個氨基酸和一個終止密碼子(TGA)，與馬鈴薯的StEBP1蛋白有89％的一致性。同時AmEBP1與擬南芥的AtG2蛋白及人的EBP1蛋白具有78％和46％的一致性。可見它們屬于在真核界保守性較高的蛋白。AmEBP1的核苷酸序列和推導出的氨基酸序列見附圖1。隨后克隆了AmEBP1基因的核DNA序列，結構分析表明，AmEBP1基因核DNA序列含有9個外顯子和8個內含子，與水稻、擬南芥同源基因的結構一致。?