[發(fā)明專利]高粱抗蚜基因緊密連鎖的SCAR標(biāo)記及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910013364.2
• 申請日: 2009-08-25
• 公開（公告）號: CN101691603A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李玥瑩;鄒劍秋;李雪梅;林鳳;劉天華;馬純艷;彭霞;陶思源;徐昕;陳琳
• 申請（專利權(quán)）人: 沈陽師范大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;A01H1/04
• 代理公司: 沈陽維特專利商標(biāo)事務(wù)所 21229
• 代理人: 甄玉荃

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及高粱抗蚜基因緊密連鎖的SCAR標(biāo)記及其應(yīng)用，特別是高粱抗蚜基因的RAPD標(biāo)記以及由該標(biāo)記轉(zhuǎn)化的SCAR標(biāo)記，以及該標(biāo)記在抗蚜品種鑒定中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

高粱(Sorghum?bicolor(L.)Moench)是世界上重要的禾谷類作物之一，主要分布在熱帶干旱和半干旱地區(qū)，溫帶和寒帶地區(qū)也有種植。從世界范圍看，它僅次于小麥、水稻、玉米、大麥，居第五位。

高粱蚜蟲[Melanaphis?sacchari(Guenée)]是我國高粱生產(chǎn)區(qū)經(jīng)常發(fā)生的主要蟲害之一，一般造成減產(chǎn)15％左右，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)減產(chǎn)達(dá)30％以上。過去采用化學(xué)藥劑防治既費(fèi)時(shí)、費(fèi)工又產(chǎn)生抗藥性，污染環(huán)境，因此選用抗性品種是最為有效的途徑。引進(jìn)新的抗性基因、培育抗性品種既可提高作物對蚜蟲的抵抗能力，又有利于環(huán)境保護(hù)。

植物病蟲害抗性的分子標(biāo)記研究和利用非常活躍并富有成效，許多學(xué)者對水稻、小麥、玉米等作物主要農(nóng)藝性狀基因進(jìn)行識別、定位和分離研究，構(gòu)建它們的基因圖譜，取得了較大的進(jìn)展(王京兆1995；李立家1998；李松濤1995；黎裕2004；儀治本2007；楊新泉2007)。在高粱方面，2000年Bhattramakki等將高粱的RFLP標(biāo)記和SSR標(biāo)記整和在一起，建立了一個(gè)含有232個(gè)SSR標(biāo)記的基因圖譜，并將這些標(biāo)記定位于高粱的十條染色體上，含蓋1406.3cM的染色體基因組。Catherine?S等(1999)利用RFLP方法分析美國高粱對于麥二叉蚜的抗性，得出抗蚜基因至少分布于9個(gè)位點(diǎn)，8個(gè)連鎖群，其中多數(shù)是不完全顯性的。2006年，常金華等用已定位到連鎖群上的微衛(wèi)星標(biāo)記和分離群體分析法，對抗蚜基因進(jìn)行了連鎖分析，發(fā)現(xiàn)1個(gè)與抗蚜基因連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR標(biāo)記)，與抗蚜基因的遺傳距離為8.7cM。

長期以來，作物育種的選擇都是依靠表現(xiàn)型進(jìn)行的，而分子標(biāo)記輔助選擇MMAS(Molecularr?Marker-Assisted?Selection)，將給傳統(tǒng)的育種研究帶來重要的變革。

本發(fā)明將RAPD和SCAR兩種標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來，以抗高粱蚜的國外高粱品種BTAM428為試材，篩選和高粱抗蚜基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，并將該標(biāo)記應(yīng)用于高粱抗蚜品種的早期選擇，淘汰感蚜基因型，加快育種進(jìn)程，節(jié)省選育所需的試驗(yàn)用地和成本，具有較大的實(shí)用價(jià)值，同時(shí)填補(bǔ)高粱抗蚜基因分子標(biāo)記輔助選擇研究的國、內(nèi)外空白。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，而通過最為有效的途徑選用抗蚜品種來解決采用化學(xué)藥劑防治高粱蚜蟲費(fèi)工、費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢，又產(chǎn)生抗藥性，污染環(huán)境的技術(shù)難題。

本發(fā)明的目的一：應(yīng)用PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得了兩個(gè)與高粱抗蚜基因緊密連鎖的OPN-07₇₂₇和OPN-07₃₇₃標(biāo)記，核苷酸序列為圖所示，并通過分子作圖構(gòu)建了抗蚜基因的連鎖圖。

本發(fā)明的目的二：將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定性、重復(fù)性強(qiáng)的SCAR標(biāo)記，并用此標(biāo)記對F₂代及部分高粱抗感品種進(jìn)行了檢測，建立抗感品種篩選的快速鑒定標(biāo)準(zhǔn)，為實(shí)踐了分子標(biāo)記輔助育種、縮短育種周期提供了技術(shù)保障。

本發(fā)明的目的三：應(yīng)用該方法選育抗蚜優(yōu)良品系，已應(yīng)用該方法選育抗蚜優(yōu)良品系，并已應(yīng)用生產(chǎn)。

本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

(1).對高粱后代的抗蚜性進(jìn)行田間及室內(nèi)的生理生化鑒定，從而建立起F₂代的抗感群體。

(2).確定提取高粱葉片總DNA的最佳方法。即CTAB-II法。

(3).應(yīng)用PCR擴(kuò)增儀，建立并優(yōu)化了高粱RAPD反應(yīng)體系，獲得了穩(wěn)定高效的RAPD擴(kuò)增結(jié)果。

(4).獲得了與高粱抗蚜基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記。應(yīng)用RAPD技術(shù)篩選500個(gè)隨機(jī)引物，共擴(kuò)增出1614條DNA譜帶，其中引物OPN-08₃₇₃和PN-07₇₂₇與抗蚜基因緊密連鎖。

(5).對抗蚜基因的RAPD標(biāo)記進(jìn)行克隆測序。將特異的DNA片段OPN-07₇₂₇和OPN-08₃₇₃回收純化之后，克隆于pMD?18-T?Vector中，測序結(jié)果表明，兩片段長分別為727bp和373bp。故將這兩個(gè)標(biāo)記命名為OPN-07₇₂₇、OPN-08₃₇₃。