[發(fā)明專利]一種海綿共生放線菌的分離篩選方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910010870.6
• 申請日: 2009-03-25
• 公開（公告）號: CN101845406A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張衛(wèi);信艷娟;黃劍宇
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/04;C12R1/04
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳;周秀梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及放線菌，具體地說是海洋環(huán)境中海綿共生放線菌的分離篩選的新方法。

背景技術(shù)

放線菌屬于好氧革蘭氏細菌，通常具有類似真菌的孢子絲，它們在自然環(huán)境中廣泛分布。放線菌是一大類有益次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)者。目前所使用的抗生素中，70％是由放線菌產(chǎn)生。而已知的微生物來源的抗腫瘤化合物，都源自于放線菌。另外放線菌的次級代謝產(chǎn)物還表現(xiàn)在抗病毒、抗感染、抗寄生、酶抑制劑等。

就海洋中放線菌而言，在海水、海泥和海洋生物中也廣泛存在。國際上報道的來源于海洋微生物活性物質(zhì)中，其中有一半以上來自放線菌，這說明了在海洋微生物資源和相關(guān)產(chǎn)物開發(fā)過程中，放線菌仍是主力軍。而且從海洋放線菌分離得到的化合物具有不同于陸地放線菌的特殊結(jié)構(gòu)，其活性也是令人欣喜。

海綿是一種原始的無脊椎動物，屬于底棲濾食性動物，生活在海洋中的巖石上，在海綿濾食過程中，許多微生物尤其是不能被消化的微生物得以在海綿體內(nèi)保留，這樣在海綿體內(nèi)和體表就富集了大量的微生物。這些微生物分布在海綿宿主細胞的胞外和胞內(nèi)，如海綿外層的胞外共生微生物和海綿中膠層的胞內(nèi)共生微生物。胞內(nèi)(包括細胞質(zhì)內(nèi)和細胞核內(nèi))的微生物可以長久的存在于細胞和細胞核內(nèi)。通過傳統(tǒng)培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)海綿中存在大量豐富的共生放線菌資源，僅有少部分放線菌獲得了純培養(yǎng)，絕大部分放線菌用目前分離培養(yǎng)方法不能獲得純培養(yǎng)，尤其是一些胞內(nèi)的共生微生物，分離和培養(yǎng)的難度較大。為了提高海綿共生放線菌的可培養(yǎng)性，本方法在篩選方法上做了改進，包括樣品前處理和選擇性培養(yǎng)基兩方面。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種簡便易行、快速有效的海綿共生放線菌的分離篩選新方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

將采集海綿樣品，通過改進的方法對樣品前處理后，將它們涂布在特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。樣品前處理包括：將采集的海綿樣品室溫干燥后研成粉末，放入60～80℃干燥箱干燥，取出樣品涼至室溫后，加入含0.1～0.2％脫脂奶粉10mM的MOPS(3-嗎啉丙磺酸)，27～28℃振蕩培養(yǎng)1～2小時，離心，保留上清，分成兩份備用。以HVA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向其中加入微量元素作為培養(yǎng)基組成成份之一(微量元素的應(yīng)用是模擬海綿微環(huán)境元素組成的含量配制微量元素加入到培養(yǎng)基中)，基質(zhì)選擇以膠凝糖代替瓊脂，碳源選擇用腐殖酸或幾丁質(zhì)配制成海綿放線菌液體(或固體)培養(yǎng)基。取一份上清直接均勻涂布于海綿放線菌固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)觀察，將另一份上清先用海綿放線菌液體培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)，然后再涂布于海綿放線菌固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)觀察。用此方法篩選得到多個種屬的放線菌菌株，說明本發(fā)明方便有效性。

一種海綿共生放線菌的分離篩選方法，經(jīng)過上述的海綿樣品前處理和培養(yǎng)基的改進，分離篩選到了多樣性的海綿共生放線菌，具體工藝步驟如下：

1)取采集的海綿樣品，用無菌手術(shù)刀切塊后稱重，樣品塊于裝有無菌海水的燒杯中洗滌3～5次，洗去樣品表面附著的微生物和其它雜質(zhì)；

2)將樣品室溫干燥后研成粉末，放入60～80℃干燥箱中干燥≥1小時，取出樣品涼至室溫；

3)取涼至室溫的樣品，每800～1000mg樣品加入8～10ml含質(zhì)量濃度0.1％脫脂奶粉的10mM的MOPS(3-嗎啉丙磺酸)，27～28℃振蕩培養(yǎng)≥1小時，1000～1200×g離心10～15分鐘，取0.1～0.2mL的上清均勻涂布于海綿放線菌固體培養(yǎng)基平板上，27～28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，觀察菌株生長情況；

4)另取8～1Oml上清加入100ml海綿放線菌液體培養(yǎng)基中，在三角燒瓶中搖瓶富集培養(yǎng)≥24小時，溫度為27～28℃，轉(zhuǎn)速為150～250轉(zhuǎn)/分鐘；

5)取富集培養(yǎng)后的海綿放線菌液體培養(yǎng)基0.5ml，加入裝有4.5ml無菌海水的試管中渦旋混勻作為原液，原液進行10^-1、10^-2、10^-3系列稀釋作為備用菌液；

6)分別取上述稀釋操作中各步的備用菌液0.1～0.2ml均勻涂布于海綿放線菌固體培養(yǎng)基平板，每種稀釋度的備用菌液涂5～10個平板；27～28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，觀察菌株生長情況；當(dāng)平板上出現(xiàn)螺旋形氣生菌絲或堅硬光滑的典型放線菌菌落后，挑取單菌落在海綿放線菌固體培養(yǎng)基平板上劃線；劃線后的平板再于27～28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5～7天，挑取單菌落繼續(xù)在海綿放線菌固體培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，重復(fù)這一過程3～5次；直到菌落長成純的單菌落；