[發明專利]食品中金黃色葡萄球菌毒素基因的檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 200910010798.7
• 申請日: 2009-03-20
• 公開（公告）號: CN101580873A
• 公開（公告）日: 2009-11-18
• 發明（設計）人: 曹際娟
• 申請（專利權）人: 曹際娟
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N30/02;C12R1/445
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司
• 代理人: 劉曉琴

技術領域

本發明涉及用于食品中金黃色葡萄球菌毒素基因的檢測試劑盒及檢測方法，尤其涉及基于PCR-DHPLC的快速檢測試劑盒和檢測方法。

背景技術

金黃色葡萄球菌在不同食物、不同溫度和pH值的條件下，產生的腸毒素是不同的。金黃色葡萄球菌腸毒素(SE)有12個血清型，分別為剝脫毒素ETA(exfoliative?toxin?A)、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA、SEJ、ETB、中毒休克毒素TSST(toxic?shock?syndrome?toxin)、SED、SEH、SEG。

金黃色葡萄球菌在pH值低于5的條件下很少產生腸毒素，當pH值高于9.8時，無論何型葡萄球菌腸毒素都不能產生。葡萄球菌在牛奶和谷粉粥上，于20℃～37℃下經4h～8h產生毒素，在5℃～6℃低溫下18d產生毒素或不產生毒素。在含水分、蛋白質和淀粉較多的食品中，葡萄球菌較易繁殖并產生毒素，如帶菌的生肉餡，于37℃下經18h～19h產生毒素，若在肉餡中加入少量饅頭碎屑，在同樣溫度下只經過8h就能產生毒素，可見淀粉對形成毒素有促進作用。

引起金黃色葡萄球菌腸毒素中毒的食品：主要為肉、奶、魚、蛋類及其制品等動物性食品。糕、涼拌切粉、剩大米飯和米酒等也曾引起過中毒；熟肉類如在熟后污染了致病葡萄球菌，又在20℃～30℃的環境下放置較長時間，則極易引起中毒；奶和奶制品以及用奶制作的冷飲(冰激凌、冰棍)和奶油糕點常是引起中毒的食品；油煎雞蛋、熏魚、油浸魚罐頭等含油脂較多的食品，在污染上致病性葡萄球菌以后也能產生毒素。金黃色葡萄球菌在空氣中氧分低時較易產生腸毒素，因此帶有此菌的食品，在通風不良的高溫下放置，極有利此菌生長并產生毒素。當食品污染了葡萄球菌并同時污染了其他微生物時，葡萄球菌的繁殖則受到抑制。如食品經加熱，原有的各種微生物已被殺死，拮抗微生物也不復存在，熟后再一次被葡萄球菌污染，則將會促進葡萄球菌的生長并形成毒素。金黃色葡萄球菌引起的食物中毒在世界各地均有發現。常發生于夏秋季節，這是因為氣溫較高，有利于細菌繁殖。但在冬季，如受到污染的食品在溫度較高的室內保存，葡萄球菌也可繁殖并產生毒素。當此細菌數＞10⁶個/克時，產生的腸毒素可引起食物中毒等病癥。

因此，建立對金黃色葡萄球菌12種毒素基因，即ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA、SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG的快速、準確、高靈敏的檢測方法就尤為必要。

發明內容

本發明首先提供用于檢測金黃色葡萄球菌12種毒素基因，即ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA、SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG的試劑盒。

本發明所述的食品中金黃色葡萄球菌毒素基因的檢測試劑盒中包括檢測溶液A和檢測溶液B：

檢測溶液A中含10mM?Tris·Cl、50mM?KCl、25mM?MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq?DNA聚合酶5U/μL及ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA六種毒素基因引物對各10μM；這6種毒素基因的特異性引物序列如下：

檢測溶液B中含10mM?Tris·Cl、50mM?KCl、25mM?MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq?DNA聚合酶5U/μL及SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG六種毒素基因引物對各10μM；檢測溶液B中這6種毒素基因的特異性引物序列如下：

本發明還提供了利用上述試劑盒檢測食品中金黃色葡萄球菌毒素基因的方法，包括如下步驟：

①PCR反應：取1ul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒中的檢測溶液A和14ul滅菌超純水，總體積25ul；另取1ul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒中的檢測溶液B和14ul滅菌超純水，總體積25ul；兩個反應體積分別在5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR擴增：

預變性：94℃，3min；

進入循環：94℃變性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35次循環；

終止延伸：72℃，7min；

②將PCR擴增產物進行DHPLC分析：

色譜柱：PS-DVB&C18DNASep色譜柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱溫：50℃；

流動相(體積比)：0.0min，55.0％緩沖溶液A，45.0％緩沖溶液B；