[發明專利]一種海洋溢油生物毒性快速檢測方法

無效

• 申請號: 200910010426.4
• 申請日: 2009-02-20
• 公開（公告）號: CN101551336A
• 公開（公告）日: 2009-10-07
• 發明（設計）人: 劉長安;張世宇
• 申請（專利權）人: 國家海洋環境監測中心
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;C12N1/20
• 代理公司: 大連八方知識產權代理有限公司
• 代理人: 高 杰

1.一種海洋溢油生物毒性快速檢測方法，其特征在于，該方法步驟如下：

一、發光細菌的培養：

菌種采用明亮發光桿菌T3變種，制備發光菌新鮮菌懸液：

(1)斜面菌種培養：在新鮮斜面上接出第一代斜面，25℃±0.5℃培養24h后立即轉接第二代斜面，25℃±0.5℃培養24h后再轉接第三代斜面，25℃±0.5℃培養24h后備用；

(2)搖瓶菌液培養：取第三代斜面菌種近一環，接種于裝有30ml細菌培養液的100ml三角燒瓶中，25℃±0.5℃，160r/min下培養24h備用；

(3)將培養后的發光細菌菌懸液稀釋至每毫升10⁸個～10⁹個細胞，初始發光度不低于800mV，備用；

斜面和菌液的營養基為：

胰蛋白胨0.5g??NaCl?3g??Na₂HPO4?0.5g??KH₂PO4?0.5g

酵母0.5g??甘油0.3g??蒸餾水100ml??固體培養基加瓊脂1.69g

二、水融合組分的制備：

配置人工海水作為水融合組分中的水溶液和稀釋水溶液，人工海水的配方為：

NaCl?????????20g

MgSO₄????????3.6g

MgCl?????????7.2g

無水CaCl₂????0.7g

蒸餾水???????1000ml

將潤滑油設置10g/L、8g/L、6g/L、4g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L?7個載荷率梯度；

制備水融合組分溶液，如果試驗材料比水密度小，應采用從容器底部攪拌試驗材料的攪拌器，而對于那些密度比水大的試驗材料，則應采用從容器頂部攪拌試驗溶液的攪拌器，攪拌器的攪拌速度應該適當、勻速，為1200-1500rpm/min，一般液面漩渦的深度為水融合組分溶液制備容器中試驗液高度的10％-35％，攪拌時間為24h，攪拌后，靜置4h；

三、發光細菌相對發光度的測定

測定時的室溫要控制在20～25℃，同一批樣品在測定過程中要求溫度波動不超過±1℃。取若干試管，給每支作為對照管的試管加1.98ml的人工海水，給每支作為樣品管的試管加1.98ml的水融合組分溶液，向每管中加入步驟一制備的備用的發光細菌菌液0.02ml，放入發光光度計中檢測；

四、半數效應載荷率EL₅₀的確定：

(1)繪制試驗材料載荷率與其相對發光度的相關曲線或相關方程；

(2)在相關曲線坐標圖上，相對發光度50％處畫一水平線，與相關曲線有一交點，該點的載荷率即是半數效果載荷EL₅₀值，如建立了相關方程，也可代入該方程求出樣品的EL₅₀值；

(3)根據的EL₅₀值鑒別不同油品的生物毒性。?