[發明專利]一種特發性血小板減少性紫癜動物模型的制作方法

無效

• 申請號: 200910010236.2
• 申請日: 2009-01-21
• 公開（公告）號: CN101480493A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發明（設計）人: 林庶茹;范穎;曲道煒;才麗平;曲怡;蔣寧
• 申請（專利權）人: 遼寧中醫藥大學
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;A01K67/027
• 代理公司: 沈陽利泰專利商標代理有限公司
• 代理人: 劉忠達

技術領域：

本發明涉及一種特發性血小板減少性紫癜動物模型的制作方法，可用于小鼠特發性血小板減少性紫癜動物模型的制作。

背景技術：

目前國內對特發性血小板減少性紫癜(ITP)的實驗研究主要采用免疫法建立動物模型，或者采取免疫法結合其它方法造模。這種造模方法被廣泛應用的原因：1)抗原制備過程簡單，成模率高。2)ITP在病理特征和愈合機理方面與人類ITP高度相似。3)ITP模型對各種抗ITP藥物敏感性高。此種模型業已成為監測潛在抗ITP化合物的標準模型。但是，此種傳統造模方法存在的顯著問題是血小板減少的程度不易掌握、血小板減少維持時間較短，需要探討小鼠血小板抗血清(APS)注射劑量、血清注射的間隔時間與血小板減少程度和維持時間長短之間的關系，以保證動物模型的成功率，有利于確定治療用藥最佳時間點及藥物效應。

發明內容：

鑒于傳統免疫法建立特發性血小板減少性紫癜動物模型的不足，本發明旨在建立一種特發性血小板減少性紫癜動物模型制作的方法，解決小鼠血小板抗血清(APS)注射劑量、注射間隔時間與血小板維持低水平時間的關系，使特發性血小板減少性紫癜的動物模型穩定可控，用于考察特發性血小板減少性紫癜的發病機制和抗血小板減少性紫癜藥物療效評價。

采用的技術方案是：

抗原的制備?BALB/C小鼠，摘眼球或眶靜脈采血，EDTA-Na₂抗凝；梯度離心分離血小板并洗滌，調整濃度為1～2×10⁹/L。

抗血清制備取以上血小板懸液分別與等量的完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑混勻成乳白色油包水狀混合物，作為抗原液。第1周取含完全弗氏佐劑的抗原液分別注射于豚鼠的后足掌、背部皮下及腹股溝；第2、3、5周取含不完全弗氏佐劑的抗原液分別注射于豚鼠后足掌、背部皮下及腹股溝，前后共4次注射，每次注射至少5點，每點100μl。于第6周取豚鼠全血，1800rpm/min離心10min后取血清，即為豚鼠抗小鼠血小板抗血清(GP-APS)，-20℃冰箱儲存備用。

抗血清的處理?GP-APS從-20℃取出，待完全融化后置于56℃水浴30min，滅活。

抗體效價的檢測?采用雙向瓊脂擴散法測定豚鼠抗體效價，確定最佳血清稀釋度，一般為1：4或1：8。

造模BALB/C小鼠，分別在第1、3、5、7、9、11、13天腹腔注射抗血清，每次100μl，在第15天取材。

該方法通過3批次重復實驗證明，此方法操作簡單，成模率在95％-98％，3周內沒有自愈傾向。解決血小板減少維持時間較短的問題。可制備出小鼠特發性血小板減少性紫癜的動物模型穩定可控，該模型在病理特征和愈合機理方面與人類特發性血小板減少性紫癜高度相似，對各種抗ITP藥物敏感性高。

具體實施方式：

以下結合實施例對本發明的具體實施方式做詳細說明。

實施例一

2006年6月5日-8月2日，應用該方法制備130只SPF級BALB/C小鼠過敏性紫癜模型，結果95％成模，評價了抗ITP中藥的療效及作用機制。完成省級課題一項。

實施例二

2007年5月8日-6月30日，應用該方法制備140只SPF級BALB/C小鼠過敏性紫癜模型，結果98％成模，評價了抗ITP中藥的療效及作用機制。完成省級課題一項。

實施例三

2008年9月3日-10月27日，應用該方法制備160只SPF級BALB/C小鼠過敏性紫癜模型，結果98％成模，評價了抗ITP中藥的療效及作用機制。完成國家教育部課題一項。