[發明專利]海藻糖合成酶及其編碼基因與它們的應用

有效

• 申請號: 200910007259.8
• 申請日: 2009-02-17
• 公開（公告）號: CN101519652A
• 公開（公告）日: 2009-09-02
• 發明（設計）人: 丁宏標;吳秀麗
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/00;C12P19/12;C12R1/06;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢

技術領域

本發明涉及一種海藻糖合成酶及其編碼基因與應用。

背景技術

海藻糖由兩個吡喃環葡萄糖以1，1-糖苷鍵連結而成，是一種非還原性二糖。海藻糖有 3種光學異構體，其中αβ和ββ型在自然界中很少存在，αα型是最常見的海藻糖，α α型海藻糖結構式如式I所示。

(式I)

海藻糖無色無嗅，口感略帶甜味，其甜度相當于蔗糖的45％。海藻糖的理化性質穩定， 不會焦糖化，不能使斐林試劑還原，也不能被α-糖苷酶水解，但能被海藻糖酶水解為兩個 葡萄糖分子。

海藻糖的制備方法：傳統方法有化學合成法和微生物抽提法，特別是酵母提取法曾經 是海藻糖的主要商品生產方式。但這些方法產品收率低，制造成本過高，價格昂貴，近年 來已經逐步被淘汰。

海藻糖的生物合成途徑有5種，磷酸化酶法利用轉基因植物生產海藻糖，有關研究在 國內外也頗為活躍。荷蘭植物生物技術公司將編碼大腸桿菌的6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷 酸海藻糖酯酶的基因OtsA和OtsB導入甜菜、馬鈴薯基因組中，然后從塊莖中提取海藻糖。 其缺點是目前塊莖中海藻糖的含量還不夠高。酶轉化法是制備海藻糖的新方法。1990年意 大利M?De?Rosa小組首先發現了能夠將淀粉水解物轉化為海藻糖的酶，但未申請專利。1994 年日本林原生化研究所發明了用兩種酶，即麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽寡 糖基海藻糖基海藻糖水解酶(MTHase)，協同作用，由淀粉直接酶法生產海藻糖。配合其 它淀粉水解酶，海藻糖轉化率可達70％。1995年林原公司實現了雙酶轉化法的工業化生 產，是當時海藻糖生產方法中成本最低的途徑。

酶轉化法分為兩種：雙酶法和單酶法。單酶法是由TreS基因編碼的海藻糖合成酶通過 分子內轉糖基作用，可把海藻糖轉化為麥芽糖：

雙酶法首先由MTSase作用于麥芽糊精末端，催化分子內的轉糖基化，形成麥芽寡糖 基海藻糖。然后在MTHase作用下斷裂麥芽寡糖和海藻糖間的α-1，4-糖苷鍵，釋放出海藻 糖。編碼麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因分別是TreY和TreZ。

這兩種酶系在自然界的微生物中廣泛存在，至少有15個菌屬含有上述單酶或雙酶系， 但主要存在于古細菌、極端環境微生物中，或是在極端環境下誘導生成。關于海藻糖生成 和代謝機制的研究一直是極端微生物(Extremophiles)研究的熱點課題，在Nature，Science等 頂級雜志上常有相關論文，也有大量研究課題，如近年的歐盟課題QLK1-CT-2000-01376； POCTI/BIO/48333/2002.有大量關于海藻糖合成酶系的基因工程表達研究，但海藻糖合成酶 基因的編碼特征特殊，在異源生物中不易表達，或表達量偏低，因此雖然有大量論文發表， 但很少有依據基因工程表達申報的專利公開，據此推測相關技術尚待研究開發。

經過聯網檢索，關于海藻糖的酶法轉化共檢索到23個專利。其中林原生化研究所的國 際專利01100417.7是日本生產海藻糖的主要方法。南寧中諾生物工程有限責任公司申請的 中國專利200410013006.9公開的一種海藻糖合成酶，在40L發酵罐水平上表達，以27.27％ 的麥芽糖為底物，轉化時間32h，轉化率70％。是目前國內生產海藻糖的主要方法。中國 專利200410013007.3、200410013008.8結果類似。

工業化生產：1995年日本林原Hayashibara公司首先實現了雙酶法規模化生產海藻糖， 大幅降低了生產成本和產品價格。目前海藻糖生產生產企業主要有日本林原研究所、美國 Cargill公司、廣西南寧中諾公司。其中廣西南寧中諾公司通過選用木薯淀粉做原料，優化 轉化工藝，已經將海藻糖的價格降低到25000元/噸。

長期以來制約海藻糖廣泛應用的根本原因是生產成本偏高。由于海藻糖和麥芽糖一樣， 都由淀粉二步轉化生成：麥芽糖由淀粉酶和糖化酶轉化，海藻糖由麥芽寡糖基海藻糖合成 酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶轉化，因此一旦海藻糖生產酶的產量、生產成本和效率能夠 和麥芽糖生產酶的一樣，海藻糖的價格就可以和麥芽糖一樣，其的產品競爭力和市場份額 將非常巨大。

發明內容

本發明的目的是提供一種海藻糖合成酶及其編碼基因與應用。