[發明專利]一株含有基因組島KpGI-2的肺炎克雷伯菌株

無效

• 申請號: 200910006605.0
• 申請日: 2009-01-24
• 公開（公告）號: CN101560480A
• 公開（公告）日: 2009-10-21
• 發明（設計）人: 呂元;陳楠;歐竑宇;蔣曉飛;李敏;楊澤華;魏取好;李剛;陳曉耘;鄧子新;賀新義
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬華山醫院;上海交通大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/22
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 包兆宜

技術領域

本發明屬于微生物動物細胞系領域，涉及肺炎克雷伯臨床耐藥菌株，具體涉及一株肺炎克雷伯臨床耐藥菌株攜帶有與細胞生長有關的新基因組島。?

背景技術

目前，臨床治療中。醫院獲得性感染病人的比例日益增高，肺炎克雷伯菌(Klebsiella?pneumoniae)是導致醫院感染的主要條件致病菌之一，常引起呼吸道感染、尿路感染等，并常表現為對多種抗生素耐藥。治療實踐發現，不同的肺炎克雷伯臨床感染菌株的感染類型、細菌耐藥種類存在著很大的不同。推測這些臨床感染菌株在基因水平上可能存在著明顯不同，因而決定了其眾多特性不同。?

近年有人提出了基因組島的概念，認為除細菌基因組的保守骨架外，還存在著一些可變基因池，這些基因可以作為一個整體在不同菌株之間水平轉移，這些可移動基因被統稱為基因組島。研究顯示，基因組島存在著一些共同的特征，包括GC含量與保守骨架序列不同，常位于tRNA基因位點后，兩端通常帶有保守的重復序列(Direct?Repeats，DR)，常攜帶有編碼整合酶或轉座酶的基因(參與基因組島的水平轉移，位點特異性重組過程)，攜帶的基因片段較大通常10kb-100kb以上等。基因組島攜帶的基因可以是某些與致病或耐藥相關的毒力因子相關基因，也可以是與抗生素抗性、代謝等相關。基因組島的水平移動使得細菌可以在短時間內獲得新基因產生新特性，對于細菌獲得致病性以及適應環境具有重要意義。?

研究顯示，基因組島也存在于肺炎克雷伯菌株中。有研究發現編碼氟甲砜霉素(Florfenicol)耐藥的基因floR位于一個43kb的基因組島上，該基因組島與肺炎克雷伯菌屬中結合性質粒R55有高度同源性。Bach?S等發現耶爾森菌屬一個與鐵轉運蛋白的合成、調節有關的致病島HPI同時也存在于肺炎克雷伯菌株中。研究認為，基因組島的存在對于細菌致病或耐藥基因的獲得以及適應環境具有重要意義。同時基因組島的存在也被認為是微生物在短時間獲得進化的主要方式之一。

由于基因組島插入宿主基因組時，常與tRNA相界。tRNA被認為是基因組島的插入熱點。歐竑宇等人利用tRNA?content?and?context(tRNAcc)分析的方法確定了E.coli中基因組島插入熱點tRNA在基因組中的位置，并通過tRIP?PCR(tRNA?site?interrogation?for?pathogenicity?islands，prophages?and?othergenomic?islands?PCR)方法證實了tRNAcc分析結果。?

發明內容

本發明的目的是通過篩選肺炎克雷伯臨床耐藥菌株，提供一株含有新的基因組島KpGI-2的肺炎克雷伯臨床多重耐藥菌株。?

本發明對51株血液、痰、尿液、傷口分泌物來源的肺炎克雷伯臨床耐藥菌株采用引物phe55U和phe55D進行tRIP?PCR擴增，得到了一個6.4kb的基因序列，定義為基因組島KpGI-2，將該含有新的基因組島KpGI-2的肺炎克雷伯臨床多重耐藥菌株命名為HS04160。已于2008年6月25日保藏，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，100101，保藏編號：CGMCC?No.2558，分類命名：肺炎克雷伯菌Klebsiella?pneumoniae。?

本發明的攜帶有基因組島的肺炎克雷伯臨床耐藥菌株HS04160分離于一位臨床尿路感染病人同時伴有白色假絲單胞菌感染，通過細菌活細胞計數試驗證明KpGI-2含有的基因與細菌的生長相關。本發明實驗顯示，KpGI-2與肺炎克雷伯臨床菌株適應新的寄生環境并進一步導致感染具有重要意義。所述的含有基因組島KpGI-2的菌株對于肺炎克雷伯菌株的致病與耐藥有著重要影響。?

本發明細胞株與肺炎克雷伯MGH78578(GenBank?accession?number：CP000647)基因組DNA?3.72Mb處相對應地phe?tRNA位點攜帶有一個新的與細胞分裂、增殖有關的基因組島，具有序列1的結構。?

所述的基因組島KpGI-2長度為6.4kb，攜帶的基因與細胞生長相關。?

本發明所述的含有KpGI-2肺炎克雷伯臨床耐藥菌株HS04160，通過下述方法識別鑒定得到：?

1)采用tRIP?PCR擴增肺炎克雷伯臨床耐藥菌株基因組島；?

2)將得到的6.4kb的PCR產物進行酶切、克隆，測序；?

3)根據測序結果設計引物PCR擴增6.4kb基因片段上下游的未知序列；?