[發(fā)明專利]用于檢測(cè)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及加工品EPSPS基因的引物

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910003367.8
• 申請(qǐng)日: 2009-01-19
• 公開（公告）號(hào): CN101781676A
• 公開（公告）日: 2010-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉彩霞;高宏偉;梁成珠;徐彪;孫敏;林超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及加工品快速篩選與檢測(cè)的方法，具體是一種快速檢測(cè)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及加工品內(nèi)含的整合基因EPSPS所用的引物序列。

背景技術(shù)

植物基因工程的迅速發(fā)展促進(jìn)了許多轉(zhuǎn)基因植物的出現(xiàn)，它們對(duì)人類健康及環(huán)境安全的影響受到全世界的廣泛關(guān)注。科學(xué)地對(duì)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品進(jìn)行長期有效地監(jiān)控，建立快速、有效的檢測(cè)方法體系，對(duì)人類健康及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。由于對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品安全性的關(guān)注及國際貿(mào)易等問題，世界許多國家紛紛出臺(tái)了嚴(yán)格的管理法規(guī)。現(xiàn)有135個(gè)國家在2000年1月對(duì)此已達(dá)成協(xié)議。如歐盟規(guī)定，食品中基因修飾物質(zhì)(genetically?modified?orgnisms，GMOs)的含量如果超過1％，就必須在標(biāo)簽上做出標(biāo)示。我國于2002年5月公布了轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的標(biāo)識(shí)規(guī)定，并于2003年3月20起正式實(shí)施。我國政府規(guī)定，凡是列入標(biāo)識(shí)管理目錄并用于銷售的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因作物應(yīng)當(dāng)加以標(biāo)識(shí)，未標(biāo)識(shí)和不按規(guī)定標(biāo)識(shí)的，不得進(jìn)口和銷售。這樣，就必須對(duì)農(nóng)作物中的GMOs進(jìn)行檢測(cè)。

除草劑是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中十分重要的生產(chǎn)資料，為拓展除草劑的應(yīng)用范圍和防止除草劑藥害，世界各國對(duì)抗除草劑作物品種的選育高度重視，現(xiàn)已育成了一系列抗除草劑的作物品種，轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆便是其中最有代表性的抗除草劑作物類型之一。草甘膦是一種非選擇性除草劑，它通過競爭性抑制莽草酸途徑中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)干擾芳香族氨基酸的生物合成而發(fā)揮毒性作用。當(dāng)前用于生產(chǎn)的抗草甘膦大豆主要是以CP4-EPSPS基因轉(zhuǎn)化大豆獲得的。轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的育成和應(yīng)用極大地拓展了草甘膦的應(yīng)用范圍和機(jī)動(dòng)性，為豆田雜草防除帶來了歷史性變革。

抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆是通過膿桿菌介導(dǎo)、PEC介導(dǎo)、電擊、花粉管通道、微注射和基因槍等方法將外源基因EPSPS導(dǎo)入大豆植株體內(nèi)而獲得的。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的方法已有不少報(bào)道，目前建立的檢測(cè)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及加工品方法主要依照檢測(cè)內(nèi)源基因Lectin，35S啟動(dòng)子，NOS終止子和目的基因EPSPS，操作比較繁瑣，且由于豆制品經(jīng)過高溫等處理基因結(jié)構(gòu)遭到破壞，較難檢測(cè)。近年來出現(xiàn)的以蛋白為目標(biāo)的檢測(cè)方法(ELISA和膠體金快速檢測(cè)試紙條法)價(jià)格昂貴，難在日常檢測(cè)中普及。LAMP技術(shù)是2000年NotomiT等發(fā)明的一種體外恒溫核酸擴(kuò)增方法，即所謂的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(Loop-mediated?isothermalamplification，簡稱LAMP)技術(shù)。因其具有高特異性、高效率和快速反應(yīng)等特點(diǎn)，可以大量擴(kuò)增所需的靶序列。該方法只需要極少的試劑費(fèi)用和一個(gè)水浴鍋即可完成絕大多數(shù)PCR檢測(cè)的過程，無論是實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)還是現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)都可以準(zhǔn)確快速靈敏的完成，是真正普及型的核酸檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)EPSPS基因設(shè)計(jì)一組特異性引物，進(jìn)而建立一種快速篩選和檢測(cè)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及加工豆制品的方法，以克服基于蛋白的檢測(cè)方法在豆制深加工產(chǎn)品檢測(cè)中的局限性，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)提供有效工具，從而加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)督監(jiān)管，確保產(chǎn)品標(biāo)簽的一致性，保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)。

本發(fā)明的主要原理為：設(shè)計(jì)一組可以識(shí)別靶DNA六個(gè)不同序列的兩個(gè)內(nèi)引物(上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物)和兩個(gè)外引物(上游外引物和下游外引物)，內(nèi)引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；其中一個(gè)內(nèi)引物首先和靶DNA雜交，隨后的鏈置換DNA合成在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個(gè)外引物啟動(dòng)，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個(gè)內(nèi)引物和一個(gè)外引物啟動(dòng)的DNA合成模板，產(chǎn)生一個(gè)原始的莖環(huán)DNA；內(nèi)引物以原始莖環(huán)DNA做模板，啟動(dòng)鏈置換DNA的合成，產(chǎn)生一個(gè)原始的莖環(huán)DNA和一個(gè)新的由兩倍莖長度的莖環(huán)DNA；在等溫條件下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模板，通過鏈置換形成多個(gè)含有靶DNA重復(fù)序列的莖環(huán)DNA，在一小時(shí)內(nèi)該循環(huán)反應(yīng)可使靶DNA累積到10⁹～10¹⁰拷貝。擴(kuò)增結(jié)果可通過熒光染料染色肉眼觀察。

本發(fā)明涉及的EPSPS基因環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)用的引物，其序列如下：

(1)上游內(nèi)引物(FIP)：5’-AATCGAGCGGCGCCTCAGGCCGTAAGGAAGGCGACACC-3’；

(2)下游內(nèi)引物(BIP)：5’-AATGCCGCCACGGGCTCGTCGCCGATGAAGGTG-3’；

(3)上游外引物(F3)：5’-CCATGGGCGCCAGGAT-3’；