[發(fā)明專利]表達(dá)輔酶A轉(zhuǎn)移酶及β-酮基硫解酶的工程菌及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910001597.0
• 申請(qǐng)日: 2009-01-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101475956A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳國(guó)強(qiáng);石振宇;胡碟;吳瓊;陳金春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N1/00;C12P7/40
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 張國(guó)良

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基因工程菌，具體地說(shuō)是一種輔酶A轉(zhuǎn)移酶及β-酮基硫解酶的表達(dá)工程菌，本發(fā)明還涉及該工程菌的構(gòu)建方法，以及該菌在微生物生產(chǎn)乙酰乙酸鹽中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

酮體(ketone?bodies)是脂肪酸在肝臟進(jìn)行正常分解代謝所生成的特殊中間產(chǎn)物，包括三種水溶性成分：乙酰乙酸(acetoacetic?acid約占30％)，β-羥丁酸(β-hydroxybutyric?acid約占70％)和極少量的丙酮(acetone)(Laffel?L，Ketone?bodies：a?review?of?physiology，pathophysiology?and?application?of?monitoring?to?diabetes.Diabetes/metabolism?research?and?reviews，1999，15(6)：412-426)，結(jié)構(gòu)式及相互關(guān)系見(jiàn)圖1。理論上講，β-羥丁酸并不屬于酮類，但它經(jīng)常與其它兩種物質(zhì)伴隨出現(xiàn)，因而統(tǒng)稱為酮體。

正常人血液中酮體含量極少，這是人體利用脂肪氧化供能的正?，F(xiàn)象。在某些生理情況(饑餓、禁食)或病理情況下(如糖尿病)，糖的來(lái)源或氧化供能障礙，脂動(dòng)員增強(qiáng)，脂肪酸就成了人體的主要供能物質(zhì)，以酮體的形式作為機(jī)體能量來(lái)源有著特殊的意義。但是，若肝中生成酮體的量超過(guò)肝外組織利用酮體的能力，二者之間失去平衡，血中濃度就會(huì)過(guò)高，導(dǎo)致酮血癥(acetonemia)和酮尿癥(acetonuria)。

乙酰乙酸(acetoacetic?acid)是酮體的重要組成成分之一，是最簡(jiǎn)單的β-酮酸，為無(wú)色油狀或漿狀液體，或晶體，能與水、醇任意混合，是一種有機(jī)弱酸，pKa為3.7。分子量102.09g/mol，熔點(diǎn)36.5℃。結(jié)構(gòu)式如式(I)所示

研究表明，乙酰乙酸及其衍生物有著重要的醫(yī)用前景。目前，對(duì)乙酰乙酸及其衍生物的直接利用還很有限，但是，隨著進(jìn)一步研究的進(jìn)行，對(duì)于乙酰乙酸及其衍生物的醫(yī)學(xué)應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。

與其他β-酮酸一樣，乙酰乙酸很不穩(wěn)定。它容易分解為丙酮和二氧化碳，反應(yīng)式見(jiàn)式II。當(dāng)乙酰乙酸以酸的形式存在時(shí)，在37℃水中它的半衰期為140min，而在堿性環(huán)境下(以陰離子形式存在)，半衰期為130h，比它的酸式降解速度慢50倍以上(Hay?R?W，et?al.，Kinetics?of?decarboxilation?of?acetoacetic?acid.Aust.J.Chem，1967，20(9)：1823-1828)。

CH₃COCH₂COOH→CH₃COCH₃+CO₂+H₂O??(II)

目前，主要通過(guò)乙酰乙酸乙酯在稀堿溶液中加熱水解生成乙酰乙酸鹽，然后酸化來(lái)制備乙酰乙酸(Robert?C，et?al.，CrystallineAcetoacetic?Acid.Journal?of?the?American?Chemical?Society，1952，74(21)：5536-5536)。但是由于乙酰乙酸鹽不穩(wěn)定，生產(chǎn)條件嚴(yán)格，所以工業(yè)上沒(méi)有很好的生產(chǎn)方法。一般來(lái)說(shuō)，乙酰乙酸的制備在0℃進(jìn)行，制備后立即使用(George?A.et?al.，Methylglyoxal-ω-Phenylhydrazone.Organic?Syntheses，1963，4：633)。

相對(duì)于純化學(xué)途徑合成有機(jī)物，用生物合成的方法具有一系列的優(yōu)點(diǎn)，包括經(jīng)濟(jì)消耗低，對(duì)環(huán)境的污染少，反應(yīng)條件寬松(37℃和標(biāo)準(zhǔn)大氣壓)等等。另外，化學(xué)方法生產(chǎn)乙酰乙酸需要強(qiáng)堿性環(huán)境，合成的強(qiáng)堿性產(chǎn)品不適于醫(yī)療應(yīng)用，微生物方法是在中性偏堿的條件下合成乙酰乙酸，這顯示出相對(duì)于化學(xué)合成巨大的優(yōu)點(diǎn)。而且隨著人們生活水平的提高，生物合成安全、副作用小的優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到重視。目前還沒(méi)有利用微生物方法生產(chǎn)乙酰乙酸鹽的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于表達(dá)β-酮基硫解酶和3-酮酸-輔酶A轉(zhuǎn)移酶的專用表達(dá)工程菌。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種表達(dá)載體，其含有β-酮基硫解酶的基因(phaA)及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(scotAB)基因。所述表達(dá)載體是將β-酮基硫解酶的基因(phaA)及3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(scotAB)克隆到表達(dá)載體中獲得。