[發(fā)明專利]一種利用微小RNA高效抑制曼地亞紅豆杉細(xì)胞合成C-14位氧化紫杉烷的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910000836.0
• 申請日: 2009-01-19
• 公開（公告）號: CN101781649A
• 公開（公告）日: 2010-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邱德有;劉敏;李鳳嵐
• 申請（專利權(quán)）人: 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/82;C12Q1/68;C12Q1/02;G01N30/02
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種有效抑制曼地亞紅豆杉(Taxus?x?media)細(xì)胞生物合成C-14位氧化紫杉烷 的方法。它屬于上世紀(jì)80年代在植物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的基因工程領(lǐng)域。植物細(xì)胞 懸浮培養(yǎng)技術(shù)作為一種新興的生物技術(shù)，能夠在大型的生物反應(yīng)器內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)出有用的藥 物，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

背景技術(shù)

紫杉醇(taxol)是Wall等首次從短葉紅豆杉(Taxus?Brevifolia)樹皮中分離得到的一種重要 的二萜類植物次生代謝產(chǎn)物。在臨床已用于治療卵巢癌、肺癌、膀胱癌、子宮癌及AIDS相關(guān) 的Karposis肉瘤等的治療，是目前應(yīng)用最廣泛的天然抗癌藥物之一。然而，目前紫杉醇主要從 紅豆杉植物樹皮中提取，生產(chǎn)1kg的紫杉醇就需要2000-3000棵紅豆杉的2000磅重的樹皮。由 于亂砍濫伐，紅豆杉野生資源遭受到了嚴(yán)重破壞。為解決這一危機(jī)，國內(nèi)外在人工栽培、紫 杉醇化學(xué)半合成與全合成、內(nèi)生真菌、紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)等領(lǐng)域進(jìn)行了探索。其中紅豆杉細(xì)胞 培養(yǎng)法被認(rèn)為是最有發(fā)展前途的途徑之一。同時(shí)，隨著紫杉醇生物合成途徑的逐步闡明及越 來越多的關(guān)鍵酶和相關(guān)酶的基因的克隆和功能重組表達(dá)，利用基因工程方法對紅豆杉細(xì)胞從 基因水平上進(jìn)行改造或?qū)Ξa(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌菌種進(jìn)行改造已有可能。已有以大腸桿菌為宿 主菌組合紫杉烯合成酶等4種酶的基因產(chǎn)生紫杉烯的報(bào)道，且產(chǎn)率達(dá)到1.3mg/L，為天然產(chǎn) 物生物合成基因的應(yīng)用提供了借鑒。如果能將細(xì)胞培養(yǎng)與基因工程法結(jié)合，則很有可能成為 解決紫杉醇資源短缺的有效途徑。紅豆杉紫杉醇生物合成全過程約20步酶促反應(yīng)，其中紫杉 二烯合酶、紫杉二烯-5a-羥化酶、紫杉烷10β-羥化酶、紫杉烷-3a-羥化酶、紫杉二烯-5a-乙酰 轉(zhuǎn)移酶、紫杉烷-2a-苯甲酰轉(zhuǎn)移酶、10-去乙酰巴卡亭III-10β-乙酰轉(zhuǎn)移酶、3-氨基-3-苯基丙酰 轉(zhuǎn)移酶和3-N-去苯甲酰-2-脫氧紫杉醇苯甲酰轉(zhuǎn)移酶等主要的相關(guān)酶基因已成功克隆與表達(dá)。 其中，紫杉烷14β-羥基化酶(簡稱14OH)存在于包括紫杉醇在內(nèi)的各種C-13氧取代的紫杉烷生 物合成分支途徑中，對該基因表達(dá)進(jìn)行抑制，則有可能阻斷中間產(chǎn)物流向C-14氧取代的紫杉 烷，而改向生成包括紫杉醇在內(nèi)的C-13氧取代的紫杉烷的途徑，從而大幅度提高后者的產(chǎn)量。 經(jīng)文獻(xiàn)檢索：Kim等，Journal?of?Microbiology?and?Biotechnology，2000，10(1)：91-94，Ketchum 等，Plant?Cell?Reports，2007，26(7)：1025-1033和國際專利：WO2007/081772，分別利用紅豆杉的 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系進(jìn)行了外源基因的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。Kim的實(shí)驗(yàn)中研究了GFP蛋白在東北紅豆杉 (Taxus?cuspidata)細(xì)胞中的表達(dá)，他們提供了GFP蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡的證據(jù)，但他們沒 有進(jìn)行任何外源目的基因的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。Ketchum等的研究中也進(jìn)行了東北紅豆杉的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)， 但他們用的是野生型的根癌和發(fā)根農(nóng)桿菌，同樣也沒有開展任何外源目的(功能)基因的轉(zhuǎn) 化工作。國際專利WO2007/081772盡管進(jìn)行了曼地亞紅豆杉外源目的(功能)基因的轉(zhuǎn)化工 作，但沒有涉及到到紫杉烷14β-羥基化酶基因的遺傳操作，更沒有涉及微小RNA基因的利用。 在利用微小RNA高效抑制曼地亞紅豆杉細(xì)胞合成C-14位氧化紫杉烷，降低曼地亞紅豆杉細(xì)胞 C-14位氧化紫杉烷含量方面，國內(nèi)外均還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用微小RNA高效抑制曼地亞紅豆杉細(xì)胞合成C-14位氧化紫 杉烷的方法。它包括如下步驟：

(1)從水稻基因組DNA中克隆得到微小RAN基因前體；

(2)構(gòu)建載體，載體宿主菌為根癌農(nóng)桿菌；

(3)農(nóng)桿菌浸泡法轉(zhuǎn)化紅豆杉細(xì)胞；

(4)篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；

(5)C-14氧取代的紫杉烷含量分析。

本發(fā)明所述方法，其中：微小RNA通過抑制曼地亞紅豆杉紫杉烷14β羥基化酶基因表達(dá) 的方式來抑制紅豆杉細(xì)胞合成C-14氧取代的紫杉烷。

本發(fā)明所述方法，其中C-14位氧化紫杉烷為sinenxan?A、sinenxan?C和Yunnanxane。

本發(fā)明所述方法，其中微小RAN基因前體為水稻微小RNA分子miRNA415，載體質(zhì)粒 為pEGAD，含有綠色熒光基因。