[發明專利]細胞培養方法

無效

• 申請號: 200880123254.5
• 申請日: 2008-12-22
• 公開（公告）號: CN101910408A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 安德烈·喬萬尼奧里;西維亞·羅伊;薇洛妮克·杜克洛;維吉妮·夏洛特;伊夫-奧利維耶·斯托弗
• 申請（專利權）人: 巴克斯特國際公司;巴克斯特保健股份有限公司
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C07K14/00
• 代理公司: 上海市華誠律師事務所 31210
• 代理人: 傅強國;涂勇

本申請要求申請日為2007年12月27日的美國臨時申請No.61/009,328的優先權，在此將其全部內容并入本文以作為參考。

技術領域

本發明涉及培養哺乳動物細胞、特別是可分泌異源和/或重組體蛋白的哺乳動物細胞、更具體地講是可分泌血液蛋白質比如凝血因子Ⅷ(在下文中稱為“因子Ⅷ”、或僅稱為“FVIII”)、ADAMTS-13、弗林蛋白酶或凝血因子Ⅶ(在下文稱為“因子Ⅶ”、或僅稱為“FVII”)的哺乳動物細胞的方法。

背景技術

凝血因子Ⅷ是在哺乳動物中發現的微量血漿糖蛋白，并且在因子Ⅹ的活化中作為IXa的輔因子被包含。因子Ⅷ的遺傳性缺乏導致出血病癥A型血友病，該疾病能夠用純化的因子Ⅷ成功地治療。該因子Ⅷ能夠由血漿中萃取出來，或者能夠通過基于重組DNA的技術而制備。在血漿中，其作為與von?Willebrand因子(vWF)的復合物而循環。

重組因子Ⅷ(rFVIII)能夠被用載有編碼因子Ⅷ分子的DNA序列的載體轉染的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞生產。某些情況下，重組因子Ⅷ與重組von?Willebrand因子(rvwf)一起被共同產生，后者可穩定因子Ⅷ。這種共同生產可能涉及到表達FVIII和VWF的各個細胞系的共培養、或者兩種蛋白質在相同細胞中的共表達。參見US?5250421(遺傳學研究所)和Kaufman等((1989)Mol.Cell.Biol.9，1233-1242)。

在用于制備重組體因子Ⅷ的典型方法中，細胞在培養基中培養并且將因子Ⅷ分泌入培養基中。然后因子FVIII可以，任選地作為與vWF的復合物，被從培養基中純化出來。

由于在本技術領域已知的方法中得到相對低的產率，所以重組因子Ⅷ的生產是昂貴的。單位細胞產量與可以得到的其他重組體蛋白的產量相比趨于較低。如果培養基不補充動物產品比如血清，培養基可能僅支持相對低的細胞密度。這會降低單位體積培養基的產量。然而，人們期望不用動物產品來補充培養基，以便降低病毒及其他可傳染性試劑的污染風險。用于生產FVIII的無動物蛋白培養基已知例如被US?6936441(巴克斯特公司)報道了。

本發明提供了用于生產血液蛋白質包括rFVIII的方法，其中產率與本技術領域已知的方法相比得到了提高。

發明內容

本發明的第一個方面提供了一種在細胞培養上清液中培養分泌異源蛋白質的哺乳動物細胞的方法，其中該細胞培養上清液保持在設定在X±0.9℃的溫度下，其中X為35.1至36.5的值，附帶條件是溫度被設定為低于37℃。

本發明的第二個方面提供了一種在細胞培養上清液中培養分泌異源蛋白質的哺乳動物細胞的方法，其中，該細胞培養上清液被保持在設定為X±0.05的pH，其中X為7.15至7.20的值，附帶條件是pH被設定為大于7.10。

本發明的第三個方面提供了一種在細胞培養上清液中培養分泌異源蛋白質的哺乳動物細胞的方法，其中該細胞培養上清液的CO₂濃度為1-10％。

本發明的第四個方面提供了一種在包含細胞培養上清液的容器中連續培養分泌FVIII的哺乳動物細胞的方法，其中，在細胞培養上清液中的細胞密度通過在線(in-line)傳感器測量，并且新鮮培養基進入容器的流入量被自動地控制，從而保持細胞的密度在期望的范圍內。

具體實施方式

在本發明第一個方面的過程中，其中哺乳動物細胞被培養的細胞培養上清液被保持在設定為X±0.9℃的溫度下，其中X為35.1至36.5的值，附帶條件是溫度被設定為低于37℃。在優選的實施方式中，溫度被設定為36±0.9℃、優選36±0.5℃、更優選36±0.2℃，并且最優選36℃；或者35.1±0.9℃、優選35.1±0.5℃、更優選35.1±0.2℃，并且最優選35.1℃；或者36.5±0.9℃、36.5±0.5℃、更優選36.5±0.2℃，并且最優選36.5℃。

術語“細胞培養上清液”是在其中培養哺乳動物細胞的培養基。該培養基不允許被與可能被加至培養物中的補料培養基相混，雖然補料培養基也優選在為細胞培養上清液所設置的溫度處被加至培養物中。術語“培養物”，我們是指細胞培養上清液和在其中培養的哺乳動物細胞。通常，在37℃下培養哺乳動物細胞。令人驚訝的是，申請人發現，在較低溫度比如36℃下培養哺乳動物細胞可提高重組體蛋白的產率。