[發明專利]人胚胎干細胞的分化

有效

• 申請號: 200880117963.2
• 申請日: 2008-11-25
• 公開（公告）號: CN101878298B
• 公開（公告）日: 2017-08-15
• 發明（設計）人: A·雷扎尼亞
• 申請（專利權）人: 生命掃描有限公司
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 權陸軍,郭文潔

技術領域

本發明提供促進多能干細胞分化的方法和與該方法相關或由該方法產生的產物。具體地講，本發明提供形成胰腺激素表達細胞和胰腺激素分泌細胞的改進方法。此外，本發明還提供在不使用飼養細胞層的情況下促進多能干細胞分化的方法和與該方法相關或由該方法產生的產物。本發明還提供在衍生自多能干細胞的胰島素產生細胞中促進葡萄糖刺激的胰島素分泌的方法。

背景技術

用于I型糖尿病的細胞替代療法的進展以及可移植胰島的缺乏已使得注意力集中在開發適于移植物移入的胰島素生成細胞或β細胞的來源上。一種方法是從多能干細胞，例如胚胎干細胞產生功能性β細胞。

在脊椎動物的胚胎發育中，多能干細胞可在稱為原腸胚形成的過程中產生包括三個胚層(外胚層、中胚層和內胚層)的一組細胞。諸如例如甲狀腺、胸腺、胰腺、腸和肝臟之類的組織將從內胚層，經由中間階段發育而來。該過程中的中間階段是形成定形內胚層。定形內胚層細胞可表達多種標志物，例如HNF-3β、GATA4、Mixll、CXCR4和Sox-17。

多能干細胞可表達階段特征性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用稱為Tra-1-60和Tra-1-81的抗體檢測的標志物中的一種或多種(Thomson等人，Science 282：1145，1998)。多能干細胞體外分化導致喪失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表達(如果存在的話)，并增加SSEA-1的表達。未分化的多能干細胞通常具有堿性磷酸酶活性，該酶可通過用4％多聚甲醛固定細胞，然后用Vector Red作為底物顯影來檢測，如生產商所描述的(Vector Laboratories，Burlingame Calif)。未分化的多能干細胞還通常表達Oct-4和TERT，這可通過RT-PCR檢測。

通常在飼養細胞層上培養多能干細胞，飼養細胞可以多種方式支持多能干細胞。或者，在培養系統中培養多能干細胞，所述培養系統基本上不含飼養細胞，但同樣支持多能干細胞的增殖而不會進行顯著的分化。使用通過此前培養另一細胞類型而調理過的培養基來支持多能干細胞在無飼養細胞的培養物中生長而不分化。作為另一種選擇，用化學成分確定的培養基來支持多能干細胞在無飼養細胞的培養物中生長而不分化。

例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnology 18：399-404(2000))和Thompson等人(Science，1998年11月6日：第282卷，第5391期，第1145-1147頁)公開了用小鼠胚胎成纖維細胞飼養細胞層來培養來自人胚泡的多能干細胞系。

Richards等人(Stem Cells 21：546-556，2003)對一組11種不同的成人、胎兒和新生兒飼養細胞層支持人多能干細胞培養的能力進行了評價。Richards等人聲稱：“在成人皮膚成纖維細胞飼養層上培養的人胚胎干細胞系保持了人胚胎干細胞形態并保持了多能性”。

US20020072117公開了可產生支持靈長類多能干細胞在無飼養細胞的培養物中生長的培養基的細胞系。所采用的細胞系是從胚胎組織獲得或從胚胎干細胞分化而來的間質細胞系和成纖維細胞樣細胞系。US20020072117還公開了所述細胞系作為原代飼養細胞層的用途。

又如，Wang等人(Stem Cells 23：1221-1227，2005)公開了用于人多能干細胞在衍生自人胚胎干細胞的飼養細胞層上長期生長的方法。

又如，Stojkovic等人(Stem Cells 2005 23：306-314，2005)公開了一種衍生自人胚胎干細胞的自發分化的飼養細胞系統。

在另一例子中，Miyamoto等人(Stem Cells 22：433-440，2004)公開了從人胎盤獲得的飼養細胞的來源。

Amit等人(Biol.Reprod 68：2150-2156，2003)公開了衍生自人包皮的飼養細胞層。

又如，Inzunza等人(Stem Cells 23：544-549，2005)公開了來自人出生后包皮成纖維細胞的飼養細胞層。

US6642048公開了可支持靈長類多能干(pPS)細胞在無飼養細胞的培養物中生長的培養基以及可用于產生這種培養基的細胞系。US6642048聲 稱：“本發明包括從胚胎組織獲得或從胚胎干細胞分化而來的間質細胞系和成纖維細胞樣細胞系。在本公開中描述并闡明了用于衍生這種細胞系、處理培養基以及用該調理培養基培育干細胞的方法”。