[發(fā)明專利]具有兩個(gè)濾波系統(tǒng)的ELISPOT方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200880114116.0
• 申請日: 2008-10-29
• 公開（公告）號: CN101855552A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: V·肖爾霍恩
• 申請（專利權(quán)）人: 自體免疫診斷有限責(zé)任公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50;G01N33/569
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李志東;林森

本發(fā)明涉及ELISPOT方法，特別是用于感染和/或傳染性疾病的體外診斷和/或體外治療監(jiān)測，以及涉及相關(guān)的試劑盒。

所謂的“酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測定(Enzyme-linked?immunospot?assay)”(ELISPOT)特別用于測量血細(xì)胞的抗原-特異性活性。測試通常在具有96孔的微量滴定板(microtiter?plates)中執(zhí)行，每個(gè)孔在底部上都具有膜，如果所述測試具有陽性結(jié)果，則圍繞獨(dú)立的活性細(xì)胞的局部顯色反應(yīng)將在膜上形成。通過對點(diǎn)簡單計(jì)數(shù)或使用數(shù)字成像處理系統(tǒng)來執(zhí)行評估，在該情形中除了點(diǎn)的數(shù)量，還可以量化點(diǎn)的尺寸和強(qiáng)度。顯色反應(yīng)是基于局部形成的信使的檢測，其經(jīng)由膜-結(jié)合的一抗而被結(jié)合。然后，通過結(jié)合二抗來顯現(xiàn)這些局部結(jié)合的信使，所述二抗針對相同的信使，這直接或間接地與顯色反應(yīng)結(jié)合。

直到現(xiàn)在，只有反應(yīng)的細(xì)胞的數(shù)量在細(xì)胞活性測試中得以測試，從而能從中得出關(guān)于它們活性的結(jié)論。然而在這點(diǎn)上，反應(yīng)的細(xì)胞的數(shù)量不是如此重要，或者不僅僅反應(yīng)的細(xì)胞的數(shù)量是重要的，而是所有個(gè)體細(xì)胞的反應(yīng)的所有性能。例如，各個(gè)細(xì)胞對抗原的反應(yīng)可能非常不同，這是由如之前所提及的，每個(gè)個(gè)體細(xì)胞所釋放的信使量以及由此引發(fā)的顯色反應(yīng)量所證明的。EP0957359A2描述了一種ELISPOT方法，其中不僅可以確定反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量，還可以確定整個(gè)反應(yīng)的強(qiáng)度。這允許得出基本上更深入的關(guān)于細(xì)胞活性的結(jié)論。

但是，ELISPOT方法的一個(gè)基本問題涉及細(xì)胞的靶向檢測，所述細(xì)胞在抗原存在的情況下分泌兩種或更多種不同的信使。另一個(gè)問題包括與其他僅分泌一種信使的細(xì)胞分開地檢測這些細(xì)胞。

正如在介紹中所提及的，在ELISPOT方法范圍內(nèi)的細(xì)胞的測量通常是基于顯色反應(yīng)，所述顯色反應(yīng)取決于對應(yīng)染料的化學(xué)發(fā)光或熒光特性。傳統(tǒng)上用于化學(xué)發(fā)光或熒光測量的濾波系統(tǒng)通常是基于單一濾波器組件，關(guān)于染料的激發(fā)和發(fā)光，所述單一濾波器組件只對特定波長范圍的光進(jìn)行傳輸。確認(rèn)無疑的是，所謂的雙濾波器至今仍被使用。但是，其缺點(diǎn)在于這些濾波器只對于相對寬的光譜范圍來說是可傳輸?shù)?。由于染料通常能夠在它們的“理想”光譜范圍外吸收和發(fā)射光，所以使用雙濾波器用于測量分泌兩種或更多種不同信使的細(xì)胞會(huì)引起對測量精確性的明顯約束。該問題基于下面事實(shí)而惡化：所述細(xì)胞通常分泌不同量的信使。

因此，本發(fā)明的目的就是提供一種ELISPOT方法，所述ELISPOT方法可以避免現(xiàn)有技術(shù)中已知的缺點(diǎn)，特別是適于對分泌兩種或更多種不同信使的細(xì)胞進(jìn)行靈敏測量。

根據(jù)本發(fā)明，該目的是由具有獨(dú)立權(quán)利要求1的特征的方法來實(shí)現(xiàn)的。該方法的優(yōu)選實(shí)施方式是從屬權(quán)利要求2至19的客體。本發(fā)明的另一方面涉及根據(jù)獨(dú)立權(quán)利要求20和21的方法的用途。本發(fā)明進(jìn)一步包括具有獨(dú)立權(quán)利要求22的特征的試劑盒。所有權(quán)利要求的措辭在此通過引用結(jié)合到該說明書的內(nèi)容中。

根據(jù)本發(fā)明的方法是ELISPOT方法(“酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測定”)，特別是用于感染和/或傳染性疾病的體外診斷和/或體外治療監(jiān)測，其特征在于真核細(xì)胞，優(yōu)選在測試表面或載體上，與抗原進(jìn)行孵育，并測量免疫活性細(xì)胞的數(shù)量，其中作為對抗原的反應(yīng)，所述免疫活性細(xì)胞分泌至少兩種不同的細(xì)胞因子，以及為了測量免疫活性細(xì)胞，借助至少兩種不同染料以及至少兩種不同的濾波器組件，使得它們得以顯現(xiàn)，所述濾波器組件包括窄帶濾波器。

本發(fā)明提供了一種ELISPOT方法，其允許相對于僅分泌一種細(xì)胞因子類型的其他免疫細(xì)胞，選擇性地檢測分泌兩種或更多種不同細(xì)胞因子的免疫細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，所述免疫細(xì)胞的選擇性測量基于具有窄帶濾波器的不同的濾波器組件的使用，其用于染料激發(fā)和發(fā)射光的限制傳輸從而允許染料發(fā)光的選擇性檢測，優(yōu)選地染料發(fā)出的熒光(窄帶濾波器是帶通濾波器，其只對窄的光譜范圍是可傳輸?shù)?。特別有利的是，因此有可能避免不同染料發(fā)光的干涉，特別是強(qiáng)發(fā)光疊加在弱發(fā)光上時(shí)。與現(xiàn)有技術(shù)中已知的ELISPOT方法相比，由此對免疫細(xì)胞來說能實(shí)現(xiàn)靈敏性的顯著地增加，所述免疫細(xì)胞在存在抗原的情況下分泌兩種或更多種的細(xì)胞因子。

在特別地優(yōu)選實(shí)施方式中，窄帶濾波器用于每個(gè)濾波器組件，所述窄帶濾波器分別補(bǔ)償染料之一的光譜特性。這樣，有利的是有可能避免前面提及的發(fā)光疊加的問題。

根據(jù)本發(fā)明，原則上，除了窄帶濾波器，濾波器組件還可以包括寬帶濾波器。但是針對免疫活性細(xì)胞的顯現(xiàn)來說，優(yōu)選使用只包含窄帶濾波器的濾波器組件。在另一個(gè)實(shí)施方式中，用每個(gè)濾波器組件中的兩個(gè)窄帶濾波器來執(zhí)行操作。根據(jù)本發(fā)明，特別是，每個(gè)濾波器組件由兩個(gè)窄帶濾波器組成。