[發明專利]樹突狀細胞的制備方法

有效

• 申請號: 200880025104.0
• 申請日: 2008-05-12
• 公開（公告）號: CN101755045A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 井上誠;長谷川護;米滿吉和;原田結
• 申請（專利權）人: 生物載體株式會社;上田泰次
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 封新琴

技術領域

本發明涉及一種樹突狀細胞的制備方法，并提供制備的樹突狀細胞及其利用方法。?

背景技術

樹突狀細胞(dendritic?cell；DC)是存在于外周血、皮膚、淋巴器官及胸腺中的抗原遞呈細胞(APC)之一，富集于淋巴組織及非淋巴組織中(參照Steinman，R.M.1991，Ann.Rev.Immunol.9：271；Banchereau，J.B.及R.M.Steinman，1998，Nature?392：245)。樹突狀細胞具有強大的抗原遞呈能力，可將抗原肽表達到樹突狀細胞的MHC?I類和MHC?II類上，并分別激活CD4、CD8?T細胞，由此誘導活體內對特定抗原(病原微生物抗原、腫瘤抗原、移植抗原等)的免疫應答。?

DC的強大免疫誘導功能非常適用于多種腫瘤的免疫療法(DC治療)。本發明者們的以往報告表明，在小鼠試驗中，用仙臺病毒(SeV)刺激的DC具有較強的抗腫瘤效果(S.Shibata?et?al.，J.Immunol，2006?177：3564-3576；Yoneyama，Y.et?al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2007，355：129-135)。而抗腫瘤療效頗受DC接種量的影響。臨床試驗也認為接種的DC量很大程度影響到治療效果，但出于患者狀態的原因，可提取的DC前體細胞(DCprogenitors)數量大多極為有限，不能獲取足夠數量的DC，因而無法達到理想的治療效果。所以，如何高效率地擴增有限的DC前體細胞，是解決問題的關鍵。?

非專利文獻1?Steinman，R.M.，1991，Ann.Rev.Immunol.9：271-296?

非專利文獻2?Banchereau，J.B.和R.M.Steinman，1998，Nature?392：245-252?

非專利文獻3?Shibata，S.et?al.，J.Immunol，2006177：3564-3576?

非專利文獻4?Yoneyama，Y.et?al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2007，355：129-135?

發明的內容?

發明要解決的問題?

鑒于以上情況，本發明所要解決的問題是提供一種可有效制備大量樹突狀細胞的方法。?

解決問題的方法?

為開發能夠有效擴增DC前體細胞并使其分化成DC的方法，本發明者們通過添加各種細胞因子，將DC前體細胞按不同時間培養，分化成DC后，以DC表面標記為指標，分析了擴增的細胞。結果發現，在含有干細胞因子(Stem?cell?factor；SCF)和白細胞介素(IL)-3的培養基中培養的DC前體細胞明顯增殖。而在上述SCF和IL-3以外再加入Flt-3配體和IL-6(即含有Flt-3配體、SCF、IL-3、IL-6(簡稱FS36))的培養基中培養的DC前體細胞的擴增更加明顯。與抽取后直接分化相比，通過GM-CSF和IL-4、以及GM-CSF和SCF分化擴增細胞所得的DC量高達幾百倍。尤其在FS36中培養約3周后分化的細胞集團，其DC比例明顯提高，由此表明FS36培養3周左右是極為優良的DC擴增方法。與以往分化方法所得DC同樣，擴增后所得細胞可通過RNA病毒的感染和LPS等，提高co-stimuratory?molecules的CD80和CD86的表達水平。另外，在含有GM-CSF和SCF的培養基中培養人CD34⁺細胞也可以顯著擴增DC。與上述方法相同，所得DC可通過LPS提高CD86的表達水平。所以，本發明提供一種可大量擴增DC前體細胞的方法，以及將所得DC前體細胞高效率分化為DC的方法。通過這些方法制備的DC可用于癌癥及感染性疾病的免疫療法。?

即，本發明涉及一種樹突狀細胞的制備方法、所制備的樹突狀細胞以及該細胞的利用方法，具體涉及?

〔1〕一種制備樹突狀細胞的方法，其包含在多種細胞因子存在下培養樹突狀細胞前體細胞的步驟。?

〔2〕〔1〕所述的方法，其中所述的多種細胞因子是粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)以及干細胞因子(SCF)。?

〔3〕〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，所述的樹突狀細胞前體細胞是來自人的細胞。?

〔4〕〔2〕或〔3〕所述的方法，其中，所述的步驟是在1ng/ml以上的GM-CSF、和0.5ng/ml以上的SCF的存在下，培養樹突狀細胞前體細胞的步驟。