[發明專利]測定外部刺激對活細胞中生物通路影響的方法

無效

• 申請號: 200880023352.1
• 申請日: 2008-05-09
• 公開（公告）號: CN101743329A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發明（設計）人: M·比特納;E·R·多爾蒂
• 申請（專利權）人: 平移基因組學研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 趙蓉民

1.測定細胞過程的活性類型和水平的原位方法，包括：

a)在一段時間內每隔一段時間反復測定啟動子活性值和定位報道基因分布值，所述一段時間足以確定被監測的細胞過程在培養條件下是否穩定，所述培養條件用于由至少一個載體轉化的至少一個非酵母真核細胞啟動子活性和定位報道基因細胞分布，其中所述至少一個載體包含：

i)至少一個由可誘導的生物通路特異性啟動子組成的盒，其中所述啟動子可操作地連接到第一可檢測標記物，和

ii)至少一個由編碼第一細胞內定位報道基因的核酸序列組成的盒；

b)使所述轉化的細胞經受外部刺激；以及

c)在暴露于刺激后一段時間內每隔一定時間反復測定所述啟動子活性值和所述定位報道基因分布值，所述一段時間足以跟蹤由暴露于刺激所引起的所述細胞過程的逐步演化，其中啟動子活性和/或報道基因定位的改變表示所述刺激的內源性生物通路調節。

2.權利要求1所述的方法，進一步包括使用觀察的已知生物化學通路的數據和人造網絡連通性與過程調節的模型數據分析時間間隔數據，以模擬觀察的所述內源性生物通路的過程和調節管道之間的連通。

3.權利要求2所述的方法，其中測定步驟(a)包括在一組轉化的非酵母細胞中測定啟動子的活性值和定位報道基因的分布值，其中每個細胞包含不同的載體，所述載體包含單獨的和不同的通路特異性啟動子，從而不同的細胞展示對施加的刺激單獨的和不同的應答，并且其中每個刺激引發的細胞過程的差異可以被分開和單獨分析。

4.權利要求3所述的方法，進一步包括應用狀態空間建模來限定控制策略，以表明所述刺激引發的細胞過程會導致擾動的細胞狀態或未擾動的細胞狀態的可能性的增加或減少。

5.權利要求1所述的方法，進一步包括確定選自細胞增殖、細胞衰老和細胞死亡的測定終點。

6.權利要求1所述的方法，其中所述啟動子對于所述細胞而言是內源性或外源性的。

7.權利要求1所述的方法，其中所述載體是質粒載體或病毒載體。

8.權利要求1所述的方法，其中所述可檢測標記物是熒光蛋白。

9.權利要求8所述的方法，其中所述熒光蛋白是熒光素酶或綠色熒光蛋白(GFP)。

10.權利要求1所述的方法，其中所述組包含約10至200個細胞。

11.權利要求1所述的方法，其中所述生物通路是內源性或外源性信號傳導通路。

12.權利要求11所述的方法，其中所述生物通路是PI₃K/Akt/mTOR通路。

13.權利要求1所述的方法，其中所述細胞是非贅生性細胞或贅生性細胞。

14.權利要求1所述的方法，其中所述定位報道基因被轉運到內部細胞膜、細胞核、高爾基體、線粒體、內質網、匯集在胞質中或其組合。

15.權利要求1所述的方法，其中測定所述值通過圖像分析完成。

16.權利要求15所述的方法，其中圖像分析包括數學形態學分割。

17.權利要求16所述的方法，其中所述分割包括：

a)活體染色所述組中的所述細胞；

b)定位來自所述活體染色和熒光的分離信號作為區域閾值二值圖像；

c)組合二值信號，以產生包含所述閾值二值圖像的第一合并圖像；

d)將標記線放置在所述熒光信號產生的谷中的拐點處，以產生第二圖像；以及

e)將所述第一合并圖像與所述第二圖像組合。

18.權利要求17所述的方法，其中所述數學形態學分割通過分水嶺法來完成。

19.權利要求17所述的方法，進一步包括將從步驟(e)獲得的啟動子活性數據與觀察的已知生物化學通路的模型數據進行比較，和調節所述已知通路的模型數據和獲自測定數據的數據之間的任何變化。

20.通過權利要求19所述的方法產生的模型。

21.權利要求1所述的方法，其中所述外部刺激是暴露于化學劑或物理因素。