[發明專利]用于鑒定/檢測微生物的反應介質

無效

• 申請號: 200880014269.8
• 申請日: 2008-04-28
• 公開（公告）號: CN101743318A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發明（設計）人: E·M·貝爾加西爾;Y·塞納廷波;M·拉姆納特;D·落筆雄
• 申請（專利權）人: 生物梅里埃公司;生物西德克斯公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 康健;林曉紅

本發明的領域是通過接種到反應介質來檢測和鑒定微生物，諸如具體是細菌或酵母。

目前存在非常多的用于檢測微生物的反應介質。這種檢測具體基于利用特定的底物，其對于希望檢測的微生物的酶特異。因此，對于細菌，通常大腸桿菌菌株通過顯示糖苷酶(osidase)類型的酶活性來證實，所述的糖苷酶活性諸如beta-葡糖醛酸糖苷酶或beta-半乳糖苷酶活性。類似地，利斯特菌可通過顯示beta-葡糖苷酶來檢測。氨基肽酶活性也可用于顯示細菌的組、屬或種。因此，丙氨酸-氨基肽酶活性，例如使得能夠區分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌。最后，還要提到檢測酯酶活性以顯示沙門氏菌。除了利用特定的底物，通過反應介質鑒定微生物或微生物的組還可基于微生物對于治療性處理的抗性。所述介質通常包含一或多種“活性”分子，諸如具體是微生物易于產生抗性的抗生素。最后，存在用于控制環境的介質，基于表面控制，使得能夠檢測例如試驗臺上的微生物的存在。為了檢測微生物在實驗室中的存在以制備抗生素，可利用包含活性分子的介質，諸如beta-內酰胺酶以抑制可能存在試驗臺上的殘留抗生素的作用，由此允許可能的微生物的生長和鑒定。

然而，活性分子在溶液中的保存通過它們在復合介質或在非常高稀釋度時的穩定性來調節。它們可根據物理化學條件快速變性，或被酶降解。例如β-內酰胺酶對于熱變性(60～70℃)敏感。抗生素也可對熱敏感。為了補償隨時間的這種降解，初始活性分子濃度必須非常高，由此使得生產費用昂貴。包含所述活性分子的介質的保存就活性而言也成了主要的問題；它們通常不能在室溫保存，這是由于持續暴露于熱會誘導介質活性分子諸如抗生素，酶等的變性。此外，即使存在低溫運輸系統(cold?chain)，反應介質通常應在生產后2-4個月內使用。由此，增加存在反應介質中的活性分子的穩定性非常重要。

由此本發明涉及通過降低制備成本和提高穩定性以延長保質期來改善介質對于目前市場上的微生物的檢測。

令人吃驚地，本發明人顯示將活性分子包囊化在環式糊精中使得可能在反應介質中的這些活性分子，從而賦予所述活性分子對于各種因子諸如熱、震動等的抗性。

環式糊精或環糊精是已知的分子。它們包含其中可安置疏水分子疏水空腔，以及使得環式糊精-疏水分子復合物能溶于含水溶劑中的疏水外表面。由于這種無極性空腔，環式糊精能在含水介質中與多種疏水宿主分子形成包含復合體。這種復合體形成的結果是在含水相中不溶的疏水分子被溶解。然而，根據申請人的知識，從未描述過這些分子能保護反應介質中的活性分子抵抗各種因子諸如熱、震動等。在反應介質中利用活性分子/環式糊精包囊化復合物由此使得能夠增加這些活性分子的穩定性并延長這些反應介質的壽命。

在繼續描述本發明之前，給出以下定義以說明本發明。

術語反應介質意圖指包含表達代謝物和/或微生物生長所必需的所有成分的介質。所述的反應介質可為固體、半固體或液體的。術語“固體介質”意圖指例如凝膠狀介質。瓊脂是常規的凝膠化劑，在微生物學中用于培養微生物，但可利用明膠或瓊脂糖。一些制備物可購得，例如Columbia瓊脂，Trypcase-soya瓊脂，Mac?Conkey瓊脂，Sabouraud瓊脂或更常見的Handbook?of?Microbiological?Media(CRC?Press)中描述的那些。

反應介質可包含組合的一或多種成分，諸如氨基酸，蛋白胨，碳水化合物，核苷酸，礦物質，微生物，活性分子諸如抗生素、酶、表面活性劑、緩沖液、磷酸鹽、銨鹽、鈉鹽、金屬鹽、一或多種使得能檢測酶活性或代謝活性的底物，等。

所述介質還包含著色劑。著色劑可指Evans藍，中性紅，綿羊血，馬血，不透明劑諸如，氧化鈦，硝基苯胺，孔雀綠，亮綠，等。

所述反應介質可為顯示介質(revealing?medium)，或培養型顯示介質。第一種情況中，所述微生物在接種前培養，第二種情況中，所述檢測和/或鑒定介質也構成培養介質。

為了本發明的目的，術語微生物包括細菌，具體是革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，酵母，和更廣泛意義上的微生物，廣泛意義上的單細胞微生物，其是裸眼不可見的，可在實驗室中擴增并操縱。