[發明專利]一種人不典型慢性粒細胞性白血病細胞株及其制備方法

有效

• 申請號: 201310596183.3
• 申請日: 2013-11-22
• 公開（公告）號: CN103667192A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 劉紅;錢娟;劉杰
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/02;A61K35/12;A61P35/02
• 代理公司: 上海順華專利代理有限責任公司 31203
• 代理人: 陳淑章

1.一種人不典型慢性粒細胞性白血病細胞株NT-1，其保藏號為CCTCC?NO：C2013103，于2013年8月1日保藏于中國典型培養物保藏中心。

2.一種如權利要求1所述的人不典型慢性粒細胞性白血病細胞株NT-1的制備方法，該方法包括以下步驟：

A、原代培養：

抽取該患者骨髓1-5ml，枸櫞酸鈉抗凝；用等體積的PBS液稀釋全血；取等體積的Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液加入10-30ml錐形離心管中，升至室溫；將離心管傾斜，用玻璃吸管吸取稀釋后的血液樣品，在分層液面上1cm處沿著管壁緩慢鋪到淋巴細胞分離液上面，注意勿打亂液層界面；配平后置于水平離心機，在室溫下2000r/min，離心15-30分鐘；將離心管平穩取出，血漿層與分層液交界處為一渾濁的灰白色層，富含單個核細胞；用無菌吸管輕輕插入到單個核細胞層，沿著管壁吸取該層，放入另一已預先盛有10-20mlPBS的試管中；將所獲得的單個核細胞在室溫下1500r/min離心10-20min，棄上清，重復洗滌1-2次，除去血小板、分離介質和抗凝物質；加入IMDM完全培養基重懸細胞，并計數細胞；置于37℃，5﹪二氧化碳培養箱內；

B、傳代：

將在IMDM完全培養基中的懸浮細胞，培養于培養皿，首先用細胞計數板計數細胞，當細胞數翻倍時，進行傳代；在超凈工作臺內，無菌條件下，吸除培養皿內培養基，轉移入無菌離心管，1500r/min，棄上清，加入IMDM完全培養基，重懸細胞，吹打均勻后依次轉移入培養皿；

C、凍存和復蘇

凍存：凍存前24小時更換新鮮的IMDM完全培養基，使細胞處于指數生長期。在超凈工作臺內，無菌條件下，吸除培養皿內培養基，轉移入無菌離心管，1500r/min，離心5-10分鐘，棄上清，加入含IMDM完全培養基，調整細胞濃度為1×10⁶～2×10⁶/ml，分裝細胞懸液至EP管，每管為1ml細胞懸液，大約1×10⁶～2×10⁶個細胞數，再次離心，1500r/min，離心5-10分鐘，棄上清，細胞沉淀加入1-3ml凍存液，吹打均勻，移入無菌凍存管，4℃30分鐘，-20℃60分鐘，-80℃過夜，次日移入液氮；

復蘇：從液氮中取出凍存管，迅速置于37℃溫水中，待凍存管中的凍存物融化成液體后，將細胞懸液吸至離心管中，1500r/min，離心10-20min,棄去上清液，細胞沉淀加IMDM完全培養基，吹打均勻至單細胞懸液，轉移入培養皿，置37℃，5%CO₂，95%濕度的CO₂培養箱中培養；

所述的IMDM完全培養基的配方為：IMDM培養基，20%胎牛血清，青霉素100單位/ml，和鏈霉素100ug/ml。

3.一種如權利要求1所述的人不典型慢性粒細胞性白血病細胞株NT-1在建立體外的人不典型慢性粒細胞性白血病動物模型中的應用。

4.一種如權利要求1所述的人不典型慢性粒細胞性白血病細胞株NT-1在制備人不典型慢性粒細胞性白血病的早期診斷試劑或試劑盒中的應用。

5.一種如權利要求1所述的人不典型慢性粒細胞性白血病細胞株NT-1在制備人不典型慢性粒細胞性白血病的藥物中的應用。