[發(fā)明專利]人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-122及其編碼基因與應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810305160.1
• 申請(qǐng)日: 2008-10-24
• 公開（公告）號(hào): CN101724067A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李建遠(yuǎn)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 李建遠(yuǎn)
• 主分類號(hào): C07K14/81
• 分類號(hào): C07K14/81;C12N15/15;C12N15/63;C12N5/10;C07K16/38;A61K38/57;A61K31/7088;A61K48/00;G01N33/68;C12Q1/68;A61P15/16;A61P31/00
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供一種新的人附睪特異表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-122，公開了編碼HEL-122蛋白的氨基酸序列和編碼本蛋白的DNA序列。本發(fā)明還公開了該蛋白的制備和檢測(cè)方法，以及生物學(xué)功能。該蛋白對(duì)精子成熟、正常受精及早期胚胎發(fā)育發(fā)揮重要作用。HEL-122蛋白可作為免疫性避孕藥的研發(fā)，以及男性不育癥的臨床診斷與治療的靶蛋白。該蛋白的研發(fā)，對(duì)男性生殖醫(yī)學(xué)意義重大。

背景技術(shù)

免疫性避孕作為一種可逆的非激素療法已經(jīng)研究了多年，并且研究重點(diǎn)是通過(guò)女性免疫來(lái)阻止懷孕或受精，而對(duì)于男性免疫避孕的研究卻很少。近年來(lái)，許多附睪蛋白酶抑制劑相繼被報(bào)道，其在宿主天然防御及男性免疫避孕等方面發(fā)揮重要作用。O’Rand等(Science，2001)報(bào)道附睪蛋白酶抑制劑EPPIN，其在人附睪和睪丸中特異表達(dá)，成功地使雄性靈長(zhǎng)類免疫避孕。研究附睪蛋白酶抑制劑在精子成熟和受精過(guò)程中發(fā)揮的重要作用，開發(fā)安全、有效的雄性靈長(zhǎng)類免疫避孕疫苗是可實(shí)現(xiàn)的。

蛋白酶抑制劑廣泛存在于生物體內(nèi)，在許多生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮必不可少的作用，特別是對(duì)蛋白酶活性進(jìn)行精確調(diào)控。附睪蛋白酶抑制劑作為附睪管腔分泌蛋白的主要成分(PenttinenJetal.，2003；ZhouCXet?al.，2004)在睪丸精子進(jìn)入附睪后的進(jìn)一步成熟過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。精子在附睪中的成熟需要管腔離子濃度的改變及一些糖苷酶和蛋白酶對(duì)精子膜表面的修飾來(lái)調(diào)控，而這些蛋白酶需要相應(yīng)的蛋白酶抑制劑調(diào)節(jié)并達(dá)到平衡(B.Robaire?et?al.，2000；N.D.Rawlings?et?al.，2004；J.L.Dacheux?et?a1.，2005)。研究附睪蛋白酶抑制劑這類重要的附睪基因，如何參與主要附睪功能調(diào)控和精子成熟的機(jī)制具有重要意義(J.Potempaet?al.，1994)。到目前為止，有關(guān)附睪蛋白酶抑制劑重組蛋白生物學(xué)功能的研究仍不多見。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種新的人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-122。

一種人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-122，它具有序列表中序列2的氨基酸序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)或多肽。

本發(fā)明的人附睪分泌蛋白命名為：HEL-122，在NVTA(55-58aa)處預(yù)測(cè)存在一個(gè)糖基化位點(diǎn)。與KAZAL型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族其他成員相比，人附睪HEL-122蛋白也含有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，并具有一典型KAZAL結(jié)構(gòu)域(47-93aa)。其氨基酸序列與黑猩猩相比有97.9％同源性，與褐鼠有53.8％同源性。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-122的基因。它是下列核苷酸序列之一：

序列表中序列1的DNA序列，GenBank注冊(cè)號(hào)為：EF426754；

編碼序列表中SEQ?ID?No.2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；

與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。

序列表中的SEQ?ID?No.1，全長(zhǎng)c?DNA序列為1022bp，定位于人5q33.1號(hào)染色體上，編碼94個(gè)氨基酸，編碼蛋白為HEL-122，含有信號(hào)肽，其開放閱讀框?yàn)?85bp，是一個(gè)完整的讀碼框。

本發(fā)明的第三方面，提供了采用基因工程技術(shù)制備具有人類附睪表達(dá)蛋白HEL-122活性多肽的方法，它包括含有上述多核苷酸序列的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。

本發(fā)明的第四方面，提供了與上述人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-122特異性結(jié)合的抗體，以及由此開發(fā)的用于附睪功能異常所致的不育癥的輔助診斷。

本發(fā)明的第五方面，提供了檢測(cè)樣本中是否存在人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-122的方法，它包括：將待測(cè)樣品與分泌蛋白的特異性抗體在一定條件下共同作用，觀察是否形成抗原抗體復(fù)合物，有抗原抗體復(fù)合物形成就提示樣品中存在分泌蛋白。

本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明蛋白和其編碼序列的用途。例如本發(fā)明蛋白可被作為診斷不育癥的分子靶點(diǎn)，或作為有效藥物成分用于治療不育癥，或作為開發(fā)新型避孕藥物的靶分子，或被用于篩選促進(jìn)人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-122活性的激動(dòng)劑拮抗劑，或被用于肽指紋圖譜鑒定。根據(jù)人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-122的編碼序列或其片段，可設(shè)計(jì)引物或探針用于PCR或核酸雜交，或者用于制備基因芯片。