[發明專利]一種水產品中恩諾沙星殘留的一步式免疫檢測方法

無效

• 申請號: 200810249718.9
• 申請日: 2008-12-22
• 公開（公告）號: CN101458253A
• 公開（公告）日: 2009-06-17
• 發明（設計）人: 曹立民;林洪;李宗妍;隋建新;許旭
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司
• 代理人: 王 鐸

1.一種水產品中恩諾沙星殘留的一步式免疫檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）首先利用生物免疫技術制備恩諾沙星特異性多克隆抗體：利用生物免疫技術免疫小鼠來制備恩諾沙星抗體，小鼠免疫后分離恩諾沙星抗血清，以30％－50％飽和度的硫酸銨沉淀粗純后，進一步利用superdexTM75柱純化；

（2）以制備的特異性抗體與辣根過氧化物酶結合形成酶標記抗體，所述酶標記抗體的制備：稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于1ml蒸餾水中，加入0.2mL新配的0.1M?NaIO_４溶液，室溫下避光攪拌20分鐘；溶液裝入透析袋中，對1mM?pH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜；取出后，加20μL?0.2M?pH9.6碳酸鹽緩沖液，使pH升高到9.0～9.6，然后立即加入溶解在1mL?0.01M碳酸鹽緩沖液中的小鼠血清抗體10mg，室溫避光輕輕攪拌2小時；加0.1mL新配的4mg/ml?NaBH_４液，混勻，再置4℃攪拌反應2小時；在攪拌下逐滴加入等體積的50%飽和度的硫酸銨，4℃靜置1小時；3000rpm?4℃離心30min，棄上清，沉淀物溶于1mL0.01M?pH7.4的PBS中，所述PBS為含有0.1％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，對0.01M?pH7.4?PBS透析，4℃過夜；次日取出后，10000rpm?4℃離心30分鐘所得上清液即為酶結合物；

（3）以96孔聚苯乙烯板為固相載體，包被相應完全抗原并進行封閉處理；

（4）對待測樣品中的恩諾沙星殘留進行分離提取，具體如下：空白樣品用電動勻漿機勻漿，準確稱取5.0g勻漿后的樣品，添加不同濃度的沙星標準品，加入5mL體積比1:1甲醇-PBS混合提取液，于高速均質機處理2min，4℃下以4000rpm離心10min，轉移上清液；沉淀用同樣方法重復處理一次，合并兩次上清；上清液再次以4℃10000rpm離心10min，棄去沉淀；上清液過0.22μm微孔濾膜；

（5）將樣品提取液、酶標記抗體液同時加入96孔板中，進行反應后利用酶標儀測定OD450值；

（6）同時以不含有待測物的提取液代替樣品液作為陰性對照，以恩諾沙星標準品的梯度稀釋液代替樣品液建立標準曲線；

（7）樣品與陰性對照進行比較，引起吸光值降低10%以上即判斷為陽性樣品，即含有待測藥物殘留，否則為陰性樣品；并根據恩諾沙星標準品的梯度曲線進行回歸分析測定待測樣品中藥物殘留的濃度。