[發(fā)明專利]選育高核酸酵母、用高核酸酵母制備核糖核酸的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810246981.2
• 申請日: 2008-12-24
• 公開（公告）號: CN101928674A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 喬賓福;俞慧君;王秀文;吳曉倩
• 申請（專利權(quán)）人: 大連珍奧生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: C12N1/18
• 分類號: C12N1/18;C07H21/00;C07H1/06;C12P19/34;C12R1/865
• 代理公司: 大連科技專利代理有限責任公司 21119
• 代理人: 于忠晶

一、技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及篩選、培養(yǎng)高核酸釀酒酵母制取核糖核酸(RNA)的技術(shù)工藝，以用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)核酸的方法。?

二、背景技術(shù)：

核糖核酸不只是基因工程研究中常用的材料，在保健食品、抗病毒抗腫瘤藥物的生產(chǎn)、食品添加劑——如肌苷酸、鳥苷酸的大規(guī)模生產(chǎn)、嬰兒奶粉中的添加都有廣泛需求，在工業(yè)上能大量生產(chǎn)核糖核酸的工藝是生物技術(shù)領(lǐng)域的重要課題之一。?

核糖核酸是生物存在的物質(zhì)基礎(chǔ)，幾乎所有生物體都含有核糖核酸，但并不是大部分生物資源都可以用來大規(guī)模提取核糖核酸，其原因是含量低、資源獲得困難或工業(yè)上無法制備。?

從微生物中提取核糖核酸是工業(yè)上最實際和有效的方法，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些最常見的微生物含有豐富的核酸，如啤酒酵母、紙漿酵母、石油酵母、面包酵母、白地霉、青霉菌菌絲體、制霉菌素菌絲體等。在各種微生物類群中核糖核酸的含量范圍幅度很大，通常在細菌中RNA占0.3-51％，在酵母中占2.7-11％，在霉菌中占0.7-28％。在菌體內(nèi)RNA含量的變化受培?養(yǎng)基組成影響甚大，其中銨離子和磷酸鹽濃度影響顯著，酵母的RNA不僅含量高并且易于提取，可用于工業(yè)化生產(chǎn)5′核苷酸。曾有學(xué)者選用500株不同的酵母菌在最好的培養(yǎng)條件下測定RNA含量，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)18小時，RNA含量在3.5-9.2％，除了野生型酵母菌株外，通過誘變育種的方法例如使用亞硝基胍(NTG)為誘變劑尋找對氯化鉀敏感的變異株可以提高菌體的核酸含量。?

選用核酸含量高的菌株，并不是用于工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)核酸的唯一要求，更重要的是選育的菌株，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中生成的菌體、核酸及其代謝產(chǎn)物對人體的安全性，在啤酒的生產(chǎn)中培養(yǎng)啤酒酵母通常用麥芽汁為碳源及營養(yǎng)源，且啤酒酵母是世界上公認的具有食用安全性的菌株。?

三、發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的之一是從釀酒酵母中選育高核酸酵母，核心技術(shù)是選育到一株安全無毒的、衛(wèi)生部許可在保健食品中使用的含高核糖核酸的酵母菌株，并配合工業(yè)上使用糖蜜為碳源，經(jīng)深層發(fā)酵培養(yǎng)獲得含高核酸的酵母菌體；目的之二是用高核酸酵母制備核糖核酸的方法，用于核酸的提取，從而完成食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域需求的核酸生產(chǎn)。?

本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是：從釀酒酵母中選育高核酸酵母，采用大量的釀酒酵母保藏菌種，經(jīng)初篩和復(fù)篩獲得一株核酸含量較高的原始菌株Y37，原始菌株Y37再經(jīng)最佳培養(yǎng)基的篩選獲得工業(yè)生產(chǎn)用高核酸酵母菌株，經(jīng)毒力試驗，菌體和代謝產(chǎn)物都無致毒反應(yīng)。?

所述初篩和復(fù)篩菌種采用的培養(yǎng)基(g/100ml)配方如下：葡萄糖3、酵母膏0.1、磷酸氫二銨1、硫酸鎂0.05、氯化鉀0.15、硫酸鋅0.001、氯化鈉0.01、硫酸亞鐵0.001，PH5.0。?

所述篩選工業(yè)生產(chǎn)用高核酸酵母所用的最佳培養(yǎng)基(g/100ml)配方如?下：糖蜜(含糖44.6％)8.0、硫酸鎂0.067、硫酸銨0.044、尿素0.044、蛋白胨0.011、硫酸亞鐵0.033、硫酸鋅0.033、磷酸(85％)0.273、PH3.9。?

本發(fā)明所述高核酸酵母制備核糖核酸的方法，對高核酸酵母菌體抽提核糖核酸，獲得的核糖核酸經(jīng)核酸酶P1降解制得核苷酸。?

所述對菌體抽提核糖核酸采用高溫食鹽法抽提。?

所述高溫食鹽法抽提核糖核酸是指采用10％食鹽在90℃高溫破碎酵母細胞，抽提核酸，其核酸收率達12-14％(W/W)，核酸含量大于90％。?

所述采用核酸酶P₁將核糖核酸降解成5′核苷酸，其降解率大于80％，其四種5′核苷酸比例符合常規(guī)核糖核酸組份。?