[發(fā)明專利]一種滅多威殘留快速檢測(cè)ELISA試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810246959.8
• 申請(qǐng)日: 2008-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101504409A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-08-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹遠(yuǎn)銀;王玉坤;王菡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/543
• 分類號(hào): G01N33/543
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種滅多威殘留的快速檢測(cè)ELISA試劑盒，主要適用于大批量水和土壤等樣品中滅多威殘留的快速測(cè)定。屬于酶免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中所創(chuàng)立的一種新的快速測(cè)定方法。

二、背景技術(shù)

滅多威(methomyl)為氨基甲酸酯類內(nèi)吸性廣譜殺蟲(chóng)劑，具有強(qiáng)烈的觸殺和胃毒作用。主要用于棉花、煙草、果樹(shù)、蔬菜防治蚜蟲(chóng)、蛾、地老虎等同翅目、鱗翅目、鞘翅目及其他害蟲(chóng)。對(duì)雌、雄大鼠急性經(jīng)口LD₅₀分別為：23.5mg/kg和17.0mg/kg，兔急性經(jīng)皮LD₅₀>5000mg/kg，屬高毒性N一甲基氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑。我國(guó)只允許在特定的作物上使用。由于此殺蟲(chóng)劑近年來(lái)較廣泛地使用，其所引起的食物中毒、誤服以及投毒事件時(shí)有發(fā)生。我國(guó)強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定甘藍(lán)和柑橘中滅多威的最高殘留限量分別為2mg/kg和5mg/kg。

滅多威的檢測(cè)方法有液相色譜、氣相色譜、及比色法等，這些方法前處理相對(duì)復(fù)雜耗時(shí)，對(duì)樣本凈化要求高，因樣本基質(zhì)成分復(fù)雜而需要建立不同的分析方法，很難滿足現(xiàn)場(chǎng)批量樣品快速檢測(cè)的需要，因此，迫切需要開(kāi)發(fā)和應(yīng)用高效率農(nóng)藥殘留快速分析技術(shù)。

酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA)特異性強(qiáng)、靈敏度高而且簡(jiǎn)便快速，可以彌補(bǔ)色譜分析方法的缺陷，本發(fā)明對(duì)解決大批量樣品的滅多威殘留現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

三、發(fā)明內(nèi)容

為了解決目前滅多威殘留儀器分析方法成本高、操作復(fù)雜、特異性差、靈敏度低和檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種具有高特異性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高精密度、操作方法簡(jiǎn)便，并能用于大批量樣品快速檢測(cè)的滅多威殘留的ELISA試劑盒。

滅多威殘留的ELISA試劑盒包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的96孔酶標(biāo)板、海綿支架和包含有濃縮洗滌液(PBST)、不同濃度的滅多威標(biāo)準(zhǔn)液、抗滅多威多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體、A液、B液和反應(yīng)終止液。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：首先將滅多威改造成適用于與載體蛋白(BSA和OVA)偶聯(lián)的半抗原滅多威琥珀酸單酯(MOSE)，利用水溶性碳化二亞胺(EDC)法將半抗原(MOSE)與牛血清白蛋白偶聯(lián)后制備人工免疫原，用該免疫原免疫新西蘭大白兔制備出滅多威多克隆抗體。再用混合酸酐法將半抗原(MOSE)與卵清蛋白偶聯(lián)，它們的復(fù)合物作為包被抗原固定于酶標(biāo)板孔壁上。預(yù)先將待測(cè)滅多威樣品和多克隆抗體混合反應(yīng)30分鐘，再將反應(yīng)后的抗原抗體加入到酶標(biāo)板孔中，固定包被抗原和待測(cè)滅多威相互競(jìng)爭(zhēng)與抗體反應(yīng)，由于各孔中的固相抗原含量和加入的抗體含量均一致，所以當(dāng)待測(cè)的滅多威濃度高時(shí)，被結(jié)合在固相抗原上的抗體(一抗)量就少，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(二抗)后，二抗與一抗的結(jié)合量就少，最后加入底物液(A液)和顯色液(B液)，顯色反應(yīng)淺(OD值低)，表明抑制率高；反之，當(dāng)待測(cè)滅多威濃度低時(shí)，則所測(cè)的OD值高，抑制率低。用已知的滅多威濃度檢測(cè)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以推算出待測(cè)滅多威的濃度。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)水和土壤中滅多威殘留，樣品地前處理過(guò)程簡(jiǎn)便，耗時(shí)少，能同時(shí)檢測(cè)大量地樣品，樣品檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法。試劑盒的保存期大于6個(gè)月。

四、附圖說(shuō)明

附圖為滅多威的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，曲線的回歸方程為y＝12.55x—3.2714(R²＝0.9984，I₅₀＝500.0ng/mL，I₂₀＝100.0ng/mL)。

五、具體實(shí)施方式

試劑盒操作及結(jié)果計(jì)算：待測(cè)樣品經(jīng)前處理后，用PBST定容備用。拆開(kāi)真空包裝袋并取出酶標(biāo)板，置室溫(20～25℃)平衡30min以上。將相同濃度的抗體分別與不同濃度(0.0，10.0，50.0，100.0，250.0，500.0，1000.0，2000.0，5000.0，10000.0ng/mL)的滅多威標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)滅多威液混合，37℃孵育30分鐘；然后將100μL此反應(yīng)混合液移入酶標(biāo)板中，37℃孵育30分鐘；取出后洗滌3次，拍干；每孔加入100μL經(jīng)PBS稀釋2000倍的羊抗兔IgG-HRP液，封板后放入37℃孵育1h，洗滌，拍干；取A液和B液等體積混勻，每孔加100μL，在暗處顯色10～15分鐘，每孔加入50μL?2moL/L的硫酸終止反應(yīng)，靜置2min，在終止液30min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD₄₉₂值。