[發明專利]一種定點刪除轉基因細胞中的外源基因的方法

有效

• 申請號: 200810246596.8
• 申請日: 2008-12-25
• 公開（公告）號: CN101760473A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發明（設計）人: 王少華;丁方榮;孫秀柱;戴蘊平;李寧
• 申請（專利權）人: 北京濟普霖生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;G01N15/10;C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種定點刪除轉基因細 胞中的外源基因的方法。

背景技術

自從1997年，體細胞克隆羊“多莉”誕生以來，利用轉有目的基 因的體細胞做供體，通過體細胞核移植技術生產轉基因家畜逐漸成為 生產轉基因大動物的主要方法。目前在獲得轉有目的基因的體細胞的 過程中，普遍采用的方法是將真核抗性基因(也稱標記基因，如 neomycin等)與目的基因構建在同一個載體上，通過細胞轉染后對 標記基因的篩選從而獲得穩定整合了外源目的基因的體細胞。然而， 轉基因動物中標記基因的存在給轉基因動物的后續研究帶來了許多 不便[1]。一，目前可以作為真核篩選基因進行轉基因動物研究的標 記基因非常有限，當轉基因動物中已存在某一選擇標記基因時，該標 記基因在隨后的再次轉基因中就不能再作為選擇標記，限制了多基因 轉基因的研究，尤其在哺乳動物基因敲除的研究中，常染色體等位基 因的雙敲除需要兩個不同的標記基因，在對另一等位基因進行敲除 前，必須進行標記基因的刪除；二，用于高效表達標記基因的外源啟 動子和增強子元件的存在可能影響目的基因整合位點附近調控元件 的作用，從而可能影響轉基因動物的表型分析。此外，對于乳腺生物 反應器研究來說，標記基因的存在使得目的蛋白的分離純化和檢測增 加了一定的難度；對于轉基因動物食品安全性評價研究，標記基因的 存在增加了轉基因動物及轉基因食品對人類健康的潛在危險，使轉基 因食品安全性評價的研究更為復雜。

因此，培育無標記基因的轉基因動物，對轉基因動物研究的進一 步發展及轉基因動物食品安全具有重大的意義。

Cre重組酶于1981年從P1噬菌體中發現，屬于λInt酶超基因 家族。Cre重組酶基因編碼區序列全長1029bp(EMBL數據庫登錄號 X03453)，編碼38kDa蛋白質。Cre重組酶是一種位點特異性重組酶， 能介導兩個34bp的LoxP位點(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATAC GAAGTTAT)之間的特異性重組，是LoxP位點間的序列或基因被刪 除。

目前，對于轉基因動物細胞中標記基因的刪除多采用1996年 Abuin等在小鼠胚胎干細胞中建立的方法。即用真核表達cre重組酶 的載體轉染細胞后，用1，3，5-三-苯甲酰基-2-去氧-2-氟-β-D-核糖 (FIAU)篩選標記基因獲得刪除的細胞。該方法需要在構建表達載 體時引入與FIAU作用的負篩選基因，同時需FIAU進行藥物篩選， 無疑增加了載體構建難度和細胞篩選步驟。

發明內容

本發明的目的在于提供一種定點刪除轉基因細胞中外源基因的 方法。

本發明的方法是將熒光蛋白基因與cre基因重組構建表達載體， 導入到目的細胞中，通過檢測熒光蛋白來篩選基因被定點刪除的細 胞。

為實現上述目的，首先構建表達熒光蛋白與cre重組酶重組表達 的表達載體。在本發明的一個實施方案中，所采用的熒光蛋白為綠熒 光蛋白(GFP)。將構建的表達載體導入目的細胞，通過流式細胞儀 分選表達熒光蛋白的細胞，這些細胞就是基因被定點刪除的細胞。

在本發明中，被定點刪除的基因是指在LoxP-N_n-LoxP(N_n表示 序列長度為n的核苷酸序列)結構當中的DNA序列，其可以是外源 基因，或者是標記基因。例如在本發明的一個實施例中，被刪除的基 因為neo標記基因。

在本發明中，目的細胞是指含有LoxP-N_n-LoxP結構需要將N_n定點刪除的細胞。

在本發明中，將表達載體導入目的細胞的手段包括各種轉化或轉 染的方法，例如磷酸鈣、脂質體介導的化學轉染方法，基因槍、電穿 孔、顯微注射等物理方法。

在本發明實施例中，通過構建表達GFP和cre的表達載體，導入 穩定整合了LoxP-neo-LoxP結構的轉基因牛耳成纖維細胞，流式細胞 儀分選細胞，經鑒定表明，GFP陽性的細胞neo基因均被刪除，而 GFP陰性的細胞則含有neo基因。說明，通過本發明方法能夠準確篩 選出基因被定點刪除的細胞。

本發明方法能夠準確篩選出基因被定點刪除的細胞，避免了藥物 篩選，為篩選基因被定點刪除的細胞，特別是標記基因刪除的細胞的 篩選提供了新途徑。對培育無標記基因的轉基因動物，對轉基因動物 研究的進一步發展及轉基因動物食品安全具有重大的意義。

附圖說明