[發(fā)明專利]一種攜帶木糖代謝相關(guān)基因的廣宿主質(zhì)粒及其構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810246561.4
• 申請日: 2008-12-25
• 公開（公告）號: CN101475955A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李十中;鄭煥娣
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/61;C12N15/54;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 史雙元

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于質(zhì)粒構(gòu)建領(lǐng)域，具體涉及一種攜帶木糖代謝相關(guān)基因的廣宿主質(zhì)粒，及該質(zhì)粒的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

隨著石油資源的不斷消耗，世界范圍內(nèi)的郵價(jià)迅速飆升，此外化石能源的大量使用對環(huán)境造成了嚴(yán)重的影響。世界各國都投入大量的人力、財(cái)力和物力進(jìn)行可再生生物質(zhì)能源的開發(fā)。其中，乙醇由于可以利用多種可再生原料生產(chǎn)而且對環(huán)境幾乎沒有污染，成為最有前景的石油替代能源之一。乙醇可以以淀粉、含糖的經(jīng)濟(jì)作物作為原料，也可以以木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)作為原料通過微生物發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)。木質(zhì)纖維素原料是地球上產(chǎn)量最大，成本最低的原料，是生產(chǎn)乙醇的最理想原料，纖維素乙醇具有非常廣闊的發(fā)展前景。木質(zhì)纖維素原料經(jīng)過化學(xué)或生物的方法可以水解為單糖，其水解物的主要成分是葡萄糖，其次是木糖，再次是阿拉伯糖，還有很少量的其它糖類。自然界中能發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的微生物大多數(shù)都只能利用木質(zhì)纖維素水解物中的葡萄糖，不能利用其中的戊糖，如木糖和阿拉伯糖。因此對原料的利用率不高，造成纖維素乙醇的生產(chǎn)成本偏高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶木糖代謝相關(guān)基因的廣宿主質(zhì)粒及它的構(gòu)建方法，為培育能利用木質(zhì)纖維素水解物中的木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的優(yōu)良菌種做了必要的準(zhǔn)備工作。

本發(fā)明提供的一種攜帶木糖代謝相關(guān)基因的廣宿主質(zhì)粒，包括四個(gè)木糖代謝相關(guān)基因，其特征在于該質(zhì)粒的序列如SEQ?ID?NO：1所示，以大腸桿菌DH5α為載體菌，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pBBR1MCS2-ABAT的大腸桿菌DH5α，分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia?coli，已于2008年11月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏登記號為CGMCC?NO.2739。

所述四個(gè)木糖代謝相關(guān)基因?yàn)槟咎钱悩?gòu)酶基因xylA、木酮糖激酶基因xylB、轉(zhuǎn)醛酶基因talA和轉(zhuǎn)酮糖酶基因tktA，均來源于E.coli?DH5α菌株。

一種攜帶木糖代謝相關(guān)基因的廣宿主質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下操作步驟：

(1)分別設(shè)計(jì)xylA、xylB、talA和tktA四種目的基因的特異性引物，以E.coli?DH5α為目的基因的來源菌株，通過PCR擴(kuò)增相應(yīng)基因；

(2)步驟(1)中得到的4種PCR產(chǎn)物與其對應(yīng)的pDONR載體進(jìn)行BP重組，得到4個(gè)目的基因的入門克??；

(3)4個(gè)目的基因的入門克隆與pDEST14進(jìn)行LR重組，最終得到pDEST14-ABAT質(zhì)粒；

(4)XbaI和NheI雙酶切pDEST14-ABAT質(zhì)粒的產(chǎn)物ABAT與XbaI單酶切的載體pBBR1MCS2連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、酶切鑒定、測序后，得到重組質(zhì)粒pBBR1MCS2-ABAT。

所述步驟(1)中的四種目的基因擴(kuò)增所用引物分別為：

(1)擴(kuò)增xylA基因所用引物

上游引物：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTNNGTGAATTATCTCAATAG

CAGTGTGAA-3’(SEQ?ID?No：2)

下游引物：

5’-GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTCAACGGACTGCACAGTTAGCCG

-3’(SEQ?ID?No：3)

(2)擴(kuò)增xylB基因所用引物

上游引物：

5’-GGGGACAACTTTGTATACAAAAGTTGNNCGGCTAACTGTGCAGTCCGTT

G-3’(SEQ?ID?No：4)

下游引物：

5’-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGGTGCATAACGATCTCCATATCT

ACCAGC-3’(SEQ?ID?No：5)

(3)擴(kuò)增talA基因所用引物

上游引物：

5’-GGGGACAACTTTTCTATACAAAGTTGNNAGTCTACAGACTTTGAGCAAG

TCCAA-3’(SEQ?ID?No：6)

下游引物：

5’-GGGGACAACTTTATTATACAAAGTTGTACCGCATCCATACTGAGTG-3’

(SEQ?ID?No：7)

(4)擴(kuò)增tktA基因所用引物

上游引物：

5’-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGNNTTGCGCAACATGCGAGCATGA