[發明專利]一種低溫堿性蛋白酶、其在洗滌劑方面的應用及該蛋白酶的產生菌

有效

• 申請號: 200810244798.9
• 申請日: 2008-12-18
• 公開（公告）號: CN101560479A
• 公開（公告）日: 2009-10-21
• 發明（設計）人: 何冰芳;柏中中;吳斌;謝承佳;姚忠
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/52;C11D3/386;C12R1/38
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司
• 代理人: 王荷英

技術領域

本發明涉及微生物應用領域，尤其涉及一種低溫堿性蛋白酶、其在洗滌劑方面的應用及該蛋白酶的產生菌。?

背景技術

酶制劑工業是生物工程的重要組成部分，其應用領域遍及輕工、食品、化工、醫藥、農業、能源及環境保護等，在國民經濟發展中起著重要的作用。目前全球生產酶制劑有60余種產品，達到工業化規模的有20余個系列。而我國只能生產20余種產品，其中能夠達到工業化規模的僅有糖化酶、α-淀粉酶和蛋白酶3種。其中，糖化酶和淀粉酶產量占酶制劑總產量的80％以上，而作為三大工業酶之一的蛋白酶的產量不足20％。由此可見，我國酶制劑產業的結構明顯不合理，蛋白酶制劑工業尚有待大力發展。?

國外從60年代開始推出枯草桿菌蛋白酶，國內1979年推出枯草桿菌蛋白酶，1990年國內枯草桿菌蛋白酶產量約13000噸，當時加酶洗衣粉僅占洗滌劑總量的10％，但目前已有90％的洗滌劑為加酶洗滌劑。此外，世界洗滌劑產量2700萬噸中，西歐人均24公斤，日本人均9公斤，美國人均32公斤，世界人均7公斤，而我國人均只有2.05公斤，可以說加酶洗滌劑是洗滌行業的國際發展趨勢，統計數據差異下掩飾的巨大商業價值不言而喻。?

另一方面，世界各地洗滌習慣的不同決定了對蛋白酶的不同要求，如在歐洲，洗滌溫度一般在25℃以上，因此使用的蛋白酶必須有較好的熱穩定性；在我國，大部分地區即使在冬天也習慣用冷水洗滌，而市場上很多研究成熟的洗滌用蛋白酶都是中溫蛋白酶，最適反應溫度在50-60℃，在低溫下并不能發揮良好的洗滌性能。因此，開發出一種洗滌劑添加劑用低溫堿性蛋白酶具有重要的實用價值。?

發明內容

本發明的目的是提供一種低溫堿性蛋白酶產生菌及該低溫堿性蛋白酶。此低溫堿性蛋白酶在低溫下仍具有較高活性，耐受較寬pH，能與多種商業洗滌劑相容，并且具有優良的去污性能。本發明還提供該低溫堿性蛋白酶在洗滌劑方面的應用。?

本發明提供一種假單胞菌屬菌株Pseudomonas?mosselii?XG1，其保藏號登記號為CCTCC?No：M?208235。?

Pseudomonas?mosselii?XG1為蛋白酶產生菌，通過以下步驟篩選獲得的：?

初篩：采集土壤樣本，采用梯度稀釋涂布法，選用不同稀釋度的樣品處理液涂布到脫脂牛奶平板上，30℃培養。選取在脫脂牛奶平板上透明圈較大的單個菌落進行分離純化，并對純菌株進行斜面保藏。?

復篩：將各純菌株接入發酵培養基中，30℃振蕩培養48h，測定蛋白酶活力，最終篩選蛋白酶產生菌XG1。?

菌株XG1為革蘭氏陰性、短桿狀小細菌，30℃培養時，在MLB平板上為淺黃色、濕潤、突起的小菌落，邊緣整齊，易挑取。20℃培養時，菌落會產生黃綠色色素。?

采用16S?rDNA序列分析，發現菌株XG1的16s?rDNA序列與Pseudomonasmosselii的16S?rDNA序列同源性高達99％，表明該菌株為Pseudomonas?mosselii，命名為Pseudomonas?mosselii?XG1。?

菌株Pseudomonas?mosselii?XG1已送中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNo：M208235，保藏日期為2008年11月21日。?

本發明提供一種菌株Pseudomonas?mosselii?XG1產生的低溫堿性蛋白酶，該低溫堿性蛋白酶基于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分子量為44-46kDa。其最適反應pH為8.5-9.5，在pH12.0的反應體系中保留最佳活力的80％-90％；最適反應溫度為35-40℃，當反應溫度為15℃時，該酶活性保留最高活力的32％-36％，當反應溫度為4℃時，該酶活性保留最高活力的14％-16％。1，10-鄰二氮雜菲和二硫蘇糖醇顯著抑制該酶活力，苯甲基磺酰氟(PMSF)對該酶活力沒有影響。?

本發明低溫堿性蛋白酶于25℃采用不同pH的緩沖體系處理1h，發現該酶在pH7.0-9.0的緩沖體系中最為穩定，在pH6.0-11.0的緩沖體系中，酶活為最高活力的90％以上；當緩沖液的pH介于5.0-6.0和pH為12.0時，酶活為最高活力的80％左右，顯示了很寬的pH耐受性。?

本發明低溫堿性蛋白酶在低溫下僅存在微弱的自我剪切現象，有利于其保藏及正常行使其功能。?