[發(fā)明專利]腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)及腺苷脫氨酶活性濃度測定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810244274.X
• 申請日: 2008-12-10
• 公開（公告）號: CN101750380A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發(fā)明（設計）人: 王爾中
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/17;G01N33/48;C12Q1/26
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領域。

背景技術(shù)

醫(yī)學研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機體細胞免疫活性有重要關系的核酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑒別診斷，重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鑒別的重要診斷標志。

腺苷脫氨酶的活性測定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。據(jù)申請人了解，目前國際上普遍采用紫外光法，其測定原理是：腺苷(白色結(jié)晶粉末)+水(H₂O)腺苷脫氨酶肌苷(Inosine)+氨離子(NH₄⁺)，此反映過程生成的肌苷會在波長為265nm處顯現(xiàn)，因此可以通過測定此波長處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無法用一般醫(yī)院的可見光分析儀測定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難以切實推廣應用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提出一種利用間接酶循環(huán)擴增法(IndirectEnzymatic?Recycling?Method)、酶比色法(Enzymatic?Colorimetric?Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple?Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行腺苷脫氨酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。

本發(fā)明腺苷脫氨酶活性濃度測定方法如下：

腺苷+水??腺苷脫氨酶??肌苷+氨

氨+2水+6高鐵細胞色素c??亞硝酸還原酶/Ca²⁺??亞硝酸+

6亞鐵細胞色素c

亞硝酸+3還原型輔酶亞硝酸還原酶氫氧化銨+3輔酶+水

這種方法應用腺苷脫氨酶(Adenosine?Deaminase；EC?3.5.4.4)酶(偶)聯(lián)亞硝酸還原酶(nitrite?reductase；EC?1.7.2.2)、另一種亞硝酸還原酶(nitritereductase；EC?1.7.1.4)酶促反應連續(xù)監(jiān)測法。腺苷脫氨酶及需要鈣離子激活的亞硝酸還原酶(EC?1.7.2.2)都作為作用酶，功能為將腺苷酶解產(chǎn)生氨，再生成亞硝酸。另一個亞硝酸還原酶(EC?1.7.1.4)作為循環(huán)酶：亞硝酸還原酶(EC?1.7.1.4)的酶促作用使亞硝酸再次產(chǎn)生氨離子(氫氧化銨)，使氨可以不斷的被重復循環(huán)利用。亞硝酸還原酶(EC?1.7.1.4)又作為顯色酶，一次可以將三個還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為三個輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算腺苷脫氨酶的活性濃度大小。

實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明腺苷脫氨酶診斷試劑較為理想：

緩沖液????????100mmol/L

穩(wěn)定劑????????500mmol/L

還原型輔酶????0.25mmol/L

亞硝酸還原酶????10000U/L

亞硝酸還原酶????10000U/L

腺苷????????????5mmol/L

高鐵細胞色素C???5mmol/L

氯化鈣??????????3mmol/L

鈣離子是亞硝酸還原酶(EC?1.7.2.2)的激活劑，因此氯化鈣可用其它鈣鹽取代。

本發(fā)明的腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)可以是單劑，包括：

緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、二個不同的亞硝酸還原酶、腺苷、高鐵細胞色素C、氯化鈣。

試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。

也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑：

試劑1

緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、高鐵細胞色素C、氯化鈣。

試劑2

緩沖液、穩(wěn)定劑、二個不同的亞硝酸還原酶。