[發明專利]乙醇診斷/測定試劑(盒)及乙醇濃度測定方法

無效

• 申請號: 200810244261.2
• 申請日: 2008-12-10
• 公開（公告）號: CN101750374A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 王爾中
• 申請（專利權）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/17;G01N33/48;C12Q1/26
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種乙醇診斷/測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定乙醇濃度的方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。

背景技術

乙醇具成癮性，酒濫用和酒依賴是當今世界范圍內最嚴重的社會經濟和公共衛生問題之一。在西方國家，酒精相關性肝病已成為死亡的第六位原因。在我國，近20年來，隨著社會經濟發展，人均酒消耗量大幅度上升，酒依賴的患病率日趨增高。

生物樣品中乙醇的定量測定方法主要有化學比色法，酶終點比色法，均相酶免疫測定法(EIA)，氣相色譜法(GC)和呼出氣乙醇分析。此外血清滲透量法可作乙醇半定量分析。

有多種化學比色法曾用于乙醇定量測定，微量擴散法是其中較簡單實用的一種，微量溢出的乙醇可使鉻酸還原成藍色的氧化鉻。

根據所用的試劑酶不同，乙醇的酶法測定分為二種：乙醇氧化酶法和乙醇脫氫酶法，與乙醇氧化酶法相比，乙醇脫氫酶法的專一性高，不會與甲醇和丙酮起催化反應。

一般認為氣相色譜法可作為參考方法，尤其在準確性和精密度要求高的法醫學乙醇測定中應用最廣。GC法的獨特優點在于特異、靈敏，且能同時分析多種揮發性醇類物質，如乙醇、甲醇、丙酮、乙醛和異丙醇。

其他乙醇的測定方法還有：均相酶免疫分析(Homogeneous?enzymeimmunoassay)、滲透量法、呼出氣乙醇分析法；用呼出氣乙醇分析儀檢測乙醇操作簡單、快速，在交通執法部門應用較多。這類儀器中一種是根據紅外光吸收原理設計的，該法測定的乙醇濃度與酶法測得的血乙醇濃度相關性很好。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提出一種利用雙倍酶循環擴增法(EnzymaticRecycling?Method)、酶比色法(Enzymatic?Colorimetric?Method)及酶(偶)聯法(Couple?Reaction)技術，計量/連續監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定乙醇濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的乙醇診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行乙醇濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。

本發明乙醇濃度測定方法如下：

乙醇+輔酶酒精脫氫酶乙醛+還原型輔酶

乙醛+水過氧化氫酶乙醇+過氧化氫

過氧化氫+輔酶NAD(P)H氧化酶還原型輔酶+氧

這種方法應用酒精脫氫酶(alcohol?dehydrogenase；EC?1.1.1.1)酶(偶)聯過氧化氫酶(Catalase；EC?1.11.1.6)、NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H?oxidase；EC1.6.3.1)酶促反應連續監測法。酒精脫氫酶作為作用酶，功能為將乙醇酶解產生乙醛。過氧化氫酶作為循環酶：過氧化氫酶的酶促作用使乙醛再次變回乙醇，使乙醇不斷地被重復循環利用。酒精脫氫酶與NAD(P)H氧化酶都作為顯色酶，將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測算出乙醇的濃度。

實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明乙醇診斷/測定試劑(盒)較為理想：

緩沖液?????????????????????100mmol/L

穩定劑?????????????????????500mmol/L

輔酶???????????????????????3mmol/L

酒精脫氫酶?????????????????10000U/L

過氧化氫酶?????????????????12000U/L

NAD(P)H氧化酶??????????????12000U/L

本發明的乙醇診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括：

緩沖液、穩定劑、輔酶、酒精脫氫酶、過氧化氫酶、NAD(P)H氧化酶。

試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。

也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑：

試劑1

緩沖液、穩定劑、輔酶。

試劑2