[發(fā)明專利]一種抵御冷凍脅迫乳桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810244122.X
• 申請(qǐng)日: 2008-12-11
• 公開（公告）號(hào): CN101440365A
• 公開（公告）日: 2009-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳堅(jiān);薛峰;張娟;堵國成;廖鮮艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12N15/74;C12N1/21;C07K5/037;C12R1/225
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

一種抵御冷凍脅迫乳桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，本發(fā)明利用高效率乳桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備，大腸桿菌谷胱甘肽基因的導(dǎo)入，NICE表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建，以及谷胱甘肽基因的誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行該基因工程菌的構(gòu)建。屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

乳桿菌是一類使用廣泛的益生菌，在食品發(fā)酵行業(yè)被廣泛應(yīng)用。由于乳桿菌的最適生長溫度一般在30℃-37℃，而在實(shí)際生產(chǎn)中，起酵物的冷凍保藏、低溫培育和發(fā)酵產(chǎn)品的冷藏過程都將使乳桿菌要經(jīng)歷遠(yuǎn)低于最適生長溫度的冷凍條件，從而影響其生命力。

研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌胞內(nèi)谷胱甘肽含量的增加能顯著提高其對(duì)于冷凍脅迫的耐受能力，但部分乳桿菌本身不具備合成谷胱甘肽的能力，或合成谷胱甘肽的能力較弱。將谷胱甘肽合成基因?qū)肴闂U菌，使其在少量食品級(jí)誘導(dǎo)物nisin的誘導(dǎo)下，自身合成谷胱甘肽，提高乳桿菌對(duì)于冷凍條件的適應(yīng)能力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種抵御冷凍脅迫乳桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，提高乳桿菌對(duì)于冷凍條件的適應(yīng)能力。

本發(fā)明的技術(shù)方案的詳細(xì)描述：一種抵御冷凍脅迫乳桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，通過高效率乳桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備，導(dǎo)入谷胱甘肽基因的質(zhì)粒pNZ3203的提取，NICE表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的質(zhì)粒pNZ9530的提取，質(zhì)粒pNZ3203和pNZ9530的導(dǎo)入，以及谷胱甘肽基因的誘導(dǎo)表達(dá)；步驟為：

(1)高效率乳桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備：

a)挑舊金山乳桿菌DSM20451^T單菌落接種到MMRS培養(yǎng)液中，30℃靜置培養(yǎng)過夜；

b)2％v/v接種至20mL?MMRS培養(yǎng)液中，30℃靜置培養(yǎng)細(xì)胞OD₆₀₀至0.5-0.8；

c)培養(yǎng)物裝至50mL預(yù)冷的無菌離心管中，5000rpm、5min離心去上清，收集菌體；

e)用與菌體等體積預(yù)冷的PEB-1洗滌菌體兩次；

e)用200μL預(yù)冷的PEB-1重懸菌體，按每份40μL分裝于5份1.5mL離心管中，保存于-80℃或直接轉(zhuǎn)化；

(2)質(zhì)粒pNZ3203的提取：

f)乳酸乳球菌NZ9000的培養(yǎng)：挑選含有插入了谷胱甘肽合成關(guān)鍵酶的基因gshA和gshB的質(zhì)粒pNZ3203的乳酸乳球菌NZ9000單菌落接種到含有25μg/mL氯霉素的15mL?GM17培養(yǎng)液中，30℃、200rpm培養(yǎng)過夜；

g)質(zhì)粒pNZ3203的提取：合并步驟f)菌懸液100mL，用博大泰克公司生產(chǎn)的革蘭氏陽性菌大量質(zhì)粒提取試劑盒按使用說明提取質(zhì)粒pNZ3203，并用200μL無菌水溶解質(zhì)粒pNZ3203；

(3)質(zhì)粒pNZ9530的提取：

h)乳酸乳球菌MG1363的培養(yǎng)：挑選含有插入了協(xié)助pNZ3203構(gòu)成NICE表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒pNZ9530的乳酸乳球菌MG1363單菌落接種到含有紅霉素50μg/mL的15mL?GM17培養(yǎng)液中，30℃、200rpm培養(yǎng)過夜；

i)質(zhì)粒pNZ9530的提取：合并步驟h)菌懸液100mL，用博大泰克公司生產(chǎn)的革蘭氏陽性菌大量質(zhì)粒提取試劑盒按使用說明提取質(zhì)粒pNZ9530，并用200μL無菌水溶解質(zhì)粒pNZ9530；

(4)質(zhì)粒pNZ3203和pNZ9530的導(dǎo)入：

j)取1μL質(zhì)粒pNZ3203和1μL質(zhì)粒pNZ9530與40μL的上述步驟e)所得的菌體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，冰浴10min；

k)采用電穿孔儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化：電壓1.75kV；電容25μF；電阻100Ω；

l)電擊完畢向電轉(zhuǎn)化杯中加入400μL添加了質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)15％蔗糖的MRS培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中，30℃靜置活化2-3h；

m)取步驟1)所得的培養(yǎng)液100μL涂布在含有25μg/mL氯霉素和50μg/mL紅霉素的MMRS瓊脂平板，30℃靜置培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)；

(5)谷胱甘肽基因的誘導(dǎo)表達(dá)：

n)將步驟m)所得單菌落接種到含有25μg/mL氯霉素和50μg/mL紅霉素的MMRS培養(yǎng)液中，30℃靜置活化2-3h；

o)在步驟n)所得培養(yǎng)液中添加終濃度為2ng/mL的nisin和5mmol/L的L-半胱氨酸，30℃培養(yǎng)36-48h，得到能在nisin誘導(dǎo)下自身產(chǎn)生谷胱甘肽的舊金山乳桿菌DSM20451^T基因工程菌菌懸液。