[發(fā)明專利]摩爾根氏變形桿菌的(D)-專一性羰基還原酶的基因序列和氨基酸組成

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810243284.1
• 申請日: 2008-12-29
• 公開（公告）號: CN101486998A
• 公開（公告）日: 2009-07-22
• 發(fā)明（設計）人: 石貴陽;張梁;丁重陽;張鵬華;盧燕;王正祥
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

摩爾根氏變形桿菌(Morganella?morganii)CMCC(B)49208的(D)-羰基還原酶的基因序列和氨基酸組成，該(D)-專一性羰基還原酶基因用于生物法拆分外消旋化合物，屬于生物工程技術領域。

背景技術

光學純d-偽麻黃堿，在醫(yī)藥上是多功能多用途的藥物。在臨床上主要用于支氣管哮喘，過敏型反應，低血壓及鼻粘膜充血腫脹引起的鼻塞等治療。由于麻黃堿分子中含有復合官能團，因此還常被用于有機合成，研制新型藥物。因此，開展麻黃堿拆分方法的研究極有意義。

利用生物法轉化制備光學純的手性化合物具有反應條件溫和，產物單一，立體選擇性、區(qū)域選擇性和化學選擇性較高，并能完成一些化學合成難以進行的反應等優(yōu)點。合成光學活性物質轉化反應大致可分為兩類：一類是把外消旋體拆分為兩個具有光學活性的對映體；另一類是從外消旋或手性的前體出發(fā)，通過催化反應得到不對稱的光學活性產物。

90年代起國際上對微生物及酶拆分手性化合物進行大量的研究。酶由氨基酸構成，其活性中心構成了一個不對稱環(huán)境，有利于對消旋體的識別，是一種高度手性的催化劑。其催化效率高，有較強的專一性。酶促拆分消旋體是比較理想的選擇。利用完整細胞對外消旋化合物進行轉，可以獲得光學純對映體，在非水相及有機—水雙相反應體系中，也可酶促轉化制備光學純化合物。

目前，部分立體選擇性氧化還原酶基因已通過基因工程手段獲得，而對于來源于Morganella?morganii?CMCC(B)49208的立體選擇性氧化還原酶基因，國內外研究很少，其基因組序列等信息幾乎為空白。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供Morganella?morganii?CMCC(B)49208的(D)-羰基還原酶的基因序列和氨基酸組成，以便利用該基因的重組菌株進行外消旋手性拆分，并為進一步研究用于手性拆分的微生物立體選擇性氧化還原酶的多樣性，轉化途徑及反應機理創(chuàng)造條件。

本發(fā)明的技術方案：摩爾根氏變形桿菌(Morganella?morganii)CMCC(B)49208的(D)-專一性羰基還原酶，其基因核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1。該摩爾根氏變形桿菌(Morganella?morganii)CMCC(B)49208的(D)-專一性羰基還原酶，其氨基酸組成為SEQ?ID?NO：2。

通過對立體選擇性氧化還原酶酶學性質進行研究，認為來源于Morganellamorganii?CMCC?490868的(D)-羰基還原酶將底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)轉化為d-偽麻黃堿的反應機理為：在NAD⁺的存在下，添加葡萄糖，葡萄糖脫氫酶，使NAD⁺還原為NADH，然后在NADH的存在下，將底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)不對稱還原為d-偽麻黃堿。

該酶催化氧化還原反應的最合適的初始pH為7.5，最合適的轉化溫度為30℃。底物MAK濃度、葡萄糖的添加量和葡萄糖脫氫酶的濃度分別為150mg/L、100μmol/L、15U/mL。

本發(fā)明所采用的微生物為摩爾根氏變形桿菌(Morganella?morganii)，保藏于中國醫(yī)學細菌保藏管理中心，保藏號CMCC(B)NO.49208。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明用轉化效果較好的菌株Morganella?morganiiCMCC(B)49208，分離獲得(D)-羰基還原酶進行不對稱轉化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)得到單一產物d-偽麻黃堿。

經轉化液組成和轉化條件優(yōu)化后，所用酶蛋白不對稱轉化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)，產物的產量有較大的提高，確定了優(yōu)化的轉化液組成和轉化條件。

獲得Morganella?morganii?CMCC(B)49208的(D)-專一性羰基還原酶的基因，并利用表達該基因的重組大腸桿菌進行外消旋手性拆分，為進一步研究用于手性拆分的微生物立體選擇性還原酶的多樣性、轉化途徑及反應機理創(chuàng)造條件。

附圖說明

圖1CMCC(B)49208的(D)-羰基還原酶的肽指紋圖譜。

具體實施方式

Morganella?morganii?CMCC(B)49208的(D)-專一性羰基還原酶基因的PCR產物經試劑盒純化后，利用BigDye測序試劑盒和應用生物系統(tǒng)自動DNA測序儀進行核苷酸序列的測序，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1，該還原酶氨基酸組成為SEQ?ID?NO：2。