[發明專利]一種蝦白斑綜合癥病毒病檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200810243140.6
• 申請日: 2008-12-09
• 公開（公告）號: CN101418352A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發明（設計）人: 薛仁宇;貢成良;曹廣力;張偉明;魏育紅;沈衛德;顧金壽;楊賀
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司
• 代理人: 陶海鋒

技術領域

本發明涉及一種檢測病毒的試劑盒及檢測方法，具體涉及一種檢測白斑綜合癥病毒的試劑盒及檢測方法。?

背景技術

自1993年以來，我國沿海對蝦養殖業常常遭受暴發性流行病的侵襲。該病傳染性強、宿主廣、致死率高，嚴重制約著我國對蝦養殖業的持續發展。現已證實對蝦暴發病的病原是白斑綜合癥病毒(WSSV)。目前WSSV已遍及亞洲主要對蝦養殖國家和地區，并已傳播到北美洲。在已報道的所有對蝦病毒中，該病毒毒力最強，危害最大，南美白對蝦、斑節對蝦、日本對蝦、墨吉對蝦、長毛對蝦、中國對蝦、印度對蝦、桃紅對蝦、藍對蝦、白對蝦、褐對蝦、刀額新對蝦、脊尾白蝦、斑節對蝦等，大部分養殖對蝦皆可被WSSV侵染，在浮游生物、海葵、糠蝦、白蝦、毛蝦、天津厚蟹、日本大眼蟹等動物中可檢測出WSSV，在蝦池的蟹、橈足類和昆蟲(Ephydridae)體內也檢到過WSSV，表明WSSV地域分布及宿主范圍非常廣泛，早在1995年國際獸疫局(OIE)、聯合國糧農組織(FAO)以及亞太地區水產養殖發展網絡中心(NACA)將其列為需要報告的重要的水生動物病毒病病原之一。?

有關WSSV的研究在病原學、病理學、流行病學以及診斷學研究方面已深入到分子水平，但由于諸多原因，到目前為止還不能完全控制WSSV的疫情，面對WSSV的傳布所能采取最主要的措施是及早發現和消滅傳染源，果斷切斷傳播途徑。這樣就需要建立和完善靈敏、準確、高效、快捷、方便的檢測方法，現有的檢測WSSV感染的方法很多，大致可以分為三類，即病原學、免疫學以及基因組檢測。?

用組織病理學和電子顯微鏡的方法來來檢測WSSV耗時長，操作繁瑣，靈敏度低，極易漏檢，不宜對大批樣品進行檢測。?

免疫學檢測制備高效價抗體是WSSV免疫檢測的關鍵，其最佳方案是制?備單克隆抗體。WSSV的單克隆抗體免疫檢測，其特異性、靈敏性和可重復性大大提高，方法快速、靈敏、簡單、低成本，在實驗條件一般的實驗室內均能進行，但這類方法的發展落后于現代分子生物學技術。?

通過基因組來檢測，以WSSV的特有序列為靶序列進行檢測，其中PCR檢測由于其快速而又特異，應用方便，還可以進一步衍生出巢式PCR(nested-PCR)，但為避免假陽性結果需設置內控引物，同時因PCR反應時間長、還需要專門的PCR儀，新近還有利用實時PCR(real-time?PCR)來檢測WSSV，更是需要專用的儀器。另外還有利用核酸雜交技術，通過原位雜交或斑點雜交來完成，原位雜交需要先制組織切片，而且此法耗時長，操作繁瑣，不適合在基層使用，斑點雜交需要把待測核酸固定于雜交膜上再行雜交、顯影，適合于批量樣品操作，但僅雜交后的顯影檢測需15小時左右，耗時長。?

近年來發展起來的環介導等溫擴增法(LAMP，loop-mediated?isothermalamplification)，該方法可以高靈敏地非常有選擇性地高效擴增靶序列(Notomiet?al.，2000)，最終的LAMP產物是是一系列反向重復的靶序列構成的莖環結構和多環花椰菜樣結構的DNA片段混合物，電泳后在凝膠上顯現不同大小區帶組成的階梯式圖譜。LAMP是一種全新的恒溫核酸擴增方法，和其它核酸擴增技術相比，其反應原理、引物設計更加復雜。但是它具有等溫擴增：只需要一個恒溫裝置就可以；高效靈敏：模板僅需要10個拷貝或更少；擴增特異性強：應用包含了六個區段的四條引物按嚴格順序進行擴增；檢測時間短：擴增可以在90min完成，比普通PCR反應還要省時間；產物可以通過直接在反應管中加SYBR?Green?I染色(由橙色轉為綠色)或用瓊脂糖凝膠電泳檢測。因此LAMP在核酸的科學研究、疾病的診斷和預防、動物胚胎的性別鑒定和轉基因食品檢測等領域得到了日益廣泛的應用。2004年Tomoya?Kono將WSSV從kuruma?shrimp中純化出來，再提取WSSV的核酸，利用LAMP技術對此核酸進行擴增，結果證實LAMP可用于WSSV相應序列的擴增；但是該方法對中提純步驟復雜而且對設備要求高，設備昂貴，適用性不普遍，另外，LAMP技術應用到實際檢測中，還需要解決的問題包括引物的設計和實驗條件的優化。

發明內容

本發明目的是提供一種檢測蝦WSSV的試劑盒及檢測方法，簡化檢測步驟，縮短檢測耗時，同時提高檢測的靈敏度和特異性。?