[發明專利]一種花生或河蝦過敏原快速檢測傳感器的制備及應用

有效

• 申請號: 200810242878.0
• 申請日: 2008-12-26
• 公開（公告）號: CN101458222A
• 公開（公告）日: 2009-06-17
• 發明（設計）人: 孫秀蘭;錢和;張平;朱衛娟;沈麗燕;寧煒;顧曉峰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種花生或河蝦過敏原快速檢測傳感器的制備方法，其特征在于：

以抗原抗體免疫反應和壓電型傳感技術為基礎，建立了食品過敏原的壓電 型免疫快速檢測傳感器，利用三電極體系在CHI400C型電化學工作站上進行檢 測，三電極體系：鉑電極作為輔助電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，金電極需 經修飾作為修飾電極、再經包被抗體作為工作電極，金電極修飾和包被抗體的 過程為；

(1)電極的清洗

金電極是傳感器的主要元件；金電極用Piranha溶液清洗10min， 保證金電極表面的清潔和高疏水性，然后依次用水和乙醇各清洗3次，利用三 電極系統在電化學工作站儀器CHI400C上進行掃描驗證；將清洗過的電極在 0.5mol/L的H₂SO₄溶液中于-0.8V～0.9V范圍內進行循環伏安掃描至穩定，掃描 后的電極再用超純水清洗干凈，晾干后在4℃條件下保存待用；

(2)電極的修飾

向檢測反應池中分別注入濃度為20mM戊二醛的50％乙醇溶液、濃度為 20mM的L-半胱氨酸L-Cys的50％乙醇溶液和濃度為20mM的1，6-己二硫醇 HDT的50％乙醇溶液，室溫下靜置1.5h，然后用超純水清洗0.5h，晾干后將電 極放入2.5mmol/L?K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₄+0.1mol/L?KNO₃+0.01mol/L?PBS溶液中 于-1V～1V范圍內循環伏安掃描至穩定，掃描后的電極再用超純水清洗干凈后 繼續浸泡在納米金溶膠中自然沉積，于室溫下過夜；

所述納米金溶膠的配置：用新制雙蒸水配制100mL質量濃度為0.01％氯金 酸溶液，置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸，在100r/min磁力攪拌下， 迅速加入預先在37℃保溫的質量濃度1％檸檬酸三鈉溶液4.5mL，保持溫度和轉 速不變，繼續攪拌加熱15min，直至溶液呈現清亮的酒紅色，室溫冷卻，4℃冰 箱保存備用；

(3)電極的包被抗體

花生或河蝦經正己烷4℃浸提過夜，冷凍離心，收集上清液；用30％-50％ 飽和度硫酸銨沉淀的蛋白質組分溶解在PBS中，分別加硫酸至pH?5.2或pH4.5 等電點，離心后沉淀物溶解在PBS中，分別得花生過敏原或河蝦過敏原；

花生或河蝦過敏原免疫得到檢測抗體；修飾后的電極超純水沖洗后浸泡 30min，花生抗體用PBS緩沖液以1∶4000稀釋或河蝦抗體用PBS緩沖液以1∶6000 稀釋，作為包被液，包被溫度4℃，包被時間3h，包被后的電極用超純水沖洗 后浸泡30min，再在1％BSA?37℃下浸泡3h，超純水清洗。

2.如權利要求1所述方法制備的花生或河蝦過敏原快速檢測傳感器的應用 方法，其特征是：

(1)待測液制備：

(a)花生或含花生樣品待測液制備：

稱取花生或含花生樣品30g，按重量體積比g/mL為1∶10浸入正己烷中脫 脂，4℃浸提過夜，冷凍離心，收集上清蛋白浸液；10mL蛋白浸液緩慢加至質 量終濃度30％飽和硫酸銨，4℃下靜置過夜，離心使沉淀，對上層清液再緩慢加 至質量終濃度50％飽和硫酸銨，靜置30min，離心，將30％-50％飽和度沉淀的 蛋白質組分溶解在PBS中，加硫酸至pH?5.2等電點，離心后沉淀物溶解在PBS 中，裝入透析袋對蒸餾水透析4h，期間換透析液一次，然后轉至PBS中繼續透 析，即得花生過敏原待測液；取待測液1mL加入傳感器反應池中進行檢測；

(b)河蝦或含河蝦樣品：

稱取去頭去殼的新鮮河蝦或河蝦樣品30g，組織搗碎后浸提，等電點沉淀的 pH值為4.5；其他步驟同(a)花生的處理，得河蝦過敏原待測液；取待測液1mL 加入傳感器反應池中進行檢測；

(2)檢測：利用三電極系統在電化學工作站儀器CHI400C上進行檢測，在 檢測反應池中加入過敏原待測液，檢測時間為500s。